PPARγ2基因Pro12Ala多态性不能预测罗格列酮改善PCOS患者的卵巢生殖功能

【摘要】 　　目的 探讨多囊卵巢综合征(PCOS)患者过氧化物酶增殖物激活受体γ2(PPARγ2)基因Pro12Ala多态性与罗格列酮疗效的关系。方法 选择本院生殖内分泌门诊150例PCOS患者，检测血清性激素水平、葡萄糖耐量试验(OGTT)、胰岛素释放试验(IRT)。135名月经周期规律的正常女性为对照组。PCOS组分为胰岛素抵抗(IR)组和非IR(NIR)组，IR组46例口服罗格列酮4mg，1次/d，共12周，3月后复测上述化验。采用多聚酶链反应限制性片段长度多态性(PCRRFLP)法检测两组受试者PPARγ2基因Pro12Ala多态性。结果 ①PCOS组和对照组脯氨酸/丙氨酸(P/A)型频率分别为6.7%和5.9%(P>0.05)，丙氨酸(Ala)等位基因频率分别为3.3%和3.0%(P>0.05)；②PCOS组睾酮(T)水平与空腹胰岛素呈正相关(r=0.69，P<0.01)；T与PPARγ2 Pro12Ala变异频率呈负相关(r=-0.91，P<0.05)，PCOSP/A组T水平小于脯氨酸/脯氨酸(P/P)组(2.24±1.14，2.58±0.83nmol/L，P<0.05)；③罗格列酮组(46例)均是P/P型基因，用药后，27例排卵(58.70%)，12人妊娠(26.10%)，胰岛素敏感指数(ISI)升高(0.02±0.01，0.03±0.01，P<0.05)，T浓度下降(3.56±0.45，2.21±0.63，P<0.05)。结论 ①PPARγ2基因Pro12Ala突变的PCOS妇女雄激素水平低下，提示Ala等位基因是一个保护基因；②罗格列酮改善PCOS患者卵巢功能的临床疗效异质性与PPARγ2Pro12Ala多态性可能无直接关系。

【关键词】 多囊卵巢综合征；PPARγ2基因；Pro12Ala多态性；生殖功能

　　ABSTRACT: Objective To investigate the relationship between polymorphism Pro12Ala of peroxisome proliferatoractivated receptorgamma 2 gene (PPARγ2) and therapeutic effect of rosiglitazone on women with polycystic ovary syndrome (PCOS). Methods A total of 150 women with polycystic ovarian syndrome (PCOS) and 135 agematched healthy women with normal menstrual cycles as control group were enrolled in this prospective study. Serum reproductive hormone level， oral glucose tolerance and insulin release were detected in the 150 PCOS women. These women with PCOS were pided into insulin resistance (IR) group and nonIR (NIR) group. The 46 women with PCOSIR were administered with rosiglitazone 4mg/d for 12 weeks. Their serum testosterone and insulin level were determined after 12 weeks. The polymorphism Pro12Ala of the PPARγ2 gene was examined by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism technique in patients with PCOS and control subjects. Results ① Frequency of Pro/Ala was 6.7% in women with PCOS and 5.9% in the controls (P>0.05)， respectively. Allele frequency of alanine was 3.3% in women with PCOS and 3.0% in the controls (P>0.05). ② Significantly positive correlation was found between serum testosterone and fasting insulin (r=0.693， P<0.01). There was a negative correlation between serum testosterone and mutation frequency of PPARγ2 Pro12Ala (r=-0.91， P<0.05). Serum testosterone level was lower in Pro/Ala group than in Pro/Pro group (2.24±1.14， 2.58±0.83 nmol/L， P<0.05) in women with PCOS. ③ The genotype was detected as Pro/Pro type in rosiglitazone group. There were 27 (58.70%) patients who ovulated and 12 (26.10%) patients who became pregnant in rosiglitazone group. Insulin sensitivity index was increased significantly (0.02±0.01， 0.03±0.01， P<0.05) and testosterone concentration was decreased significantly (3.56±0.45， 2.21±0.63， P<0.05) after rosiglitazone treatment in rosiglitazone group. Conclusion ① Serum testosterone level was lower in PCOS women with polymorphism Pro12Ala of PPARγ2 gene， which suggests that alanine allele can be a protective gene; ② Polymorphism Pro12Ala of PPARγ2 gene cannot predict the ovarian reproductive function through rosiglitazone in women with polycystic ovarian syndrome.

　　KEY WORDS: polycystic ovarian syndrome (PCOS); PPARγ2 gene; Pro12Ala polymorphism; reproduction function

　　多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome， PCOS)是育龄妇女最常见的生殖功能障碍、内分泌紊乱及代谢异常性疾病，影响着5%-10%的育龄妇女，高雄激素血症和胰岛素抵抗(insulin resistance， IR)是PCOS的主要病理生理学特征。胰岛素增敏剂(罗格列酮)是治疗PCOS的常规用药[1]。我们前期研究结果表明，PCOS患者口服罗格列酮可改善糖代谢，恢复排卵，但表现出临床疗效的异质性[2]。由此促使我们探讨过氧化物酶增殖物激活受体γ2(peroxisome proliferatoractivated receptorγ2， PPARγ2)基因第12位密码子CCA至GCA改变，即脯氨酸替换丙氨酸(proline12 alanine， Pro12Ala)的多态性与罗格列酮改善PCOS卵巢生殖功能的关系，从基因水平为预测罗格列酮的临床疗效提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　选择2004年元月至2005年12月西安交通大学医学院第一附属医院生殖内分泌门诊就诊的PCOS患者150例为PCOS组。以鹿特丹诊断标准[3]3项中有2项确诊PCOS：①稀发排卵或无排卵；②高雄激素症；③一侧或双侧卵巢内存在直径2-9mm卵泡≥12个。并除外高雄激素血症的其他病因。再依据空腹胰岛素(fasting insulin， FIns)水平，将PCOS组再分为胰岛素抵抗(insulin resistance， IR)组(59例)和非IR组(NIR，91例)。一般以FIns>15mu/L诊断IR。IR组中，46例患者口服罗格列酮，4mg/d，共12周，3月后复测性激素、葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test， OGTT)和胰岛素释放试验(insulin releasing test， IRT)。观察基础体温、月经、排卵、妊娠等，当尿妊娠试验阳性时，停止罗格列酮。所有受试者近3个月未用任何激素，肝肾功正常，并选择年龄相似月经周期规律的135名生育年龄妇女为对照组。

　　1.2 血清性激素的测定

　　PCOS组均于月经周期5-6d(闭经者随机)上午9-10时采空腹静脉血5mL，分离血清，放免法测定性激素。次日行OGTT和IRT。计算胰岛素敏感指数[ISI=1/FPG(mmol/L)×FIns(mu/L)]和胰岛素曲线下面积[AUCIns=1/2(FIns+ Ins 3h)+Ins 1h+Ins 2h]。对照组于月经周期5-6d测睾酮(testosterone， T)。

　　1.3 PPARγ2基因Pro12Ala多态性检测

　　采用多聚酶链反应限制性片段长度多态性法检测。具体步骤：①提取基因组DNA；②PCR扩增PPARγ2基因外显子B Pro12Ala多态位点的DNA片段：以基因组DNA为模板，进行PCR扩增。上游引物：5′GCCAGCCAATGCCAATTCAAGCCCAGTC3′；下游引物：5′GATATGTTTGCAGACAGTGTATCAGTGAAGGAATCGCTTTCCG3′(北京天为时代公司合成)；③限制性内切酶酶切：PCR片段5′第43bp处存在CCA至GCA碱基，突变时则产生限制性内切酶Msp1的酶切位点，消化后产生43bp和224bp两个片段；无此突变，不被Msp1酶消化，片段长度为267bp。据此在30g/L琼脂糖凝胶电泳检测时，P/P纯合子为一条电泳带(267bp)；P/A杂合子为三条电泳带(43bp、224bp和267bp)。

　　1.5 统计学处理

　　以HardyWeinberg平衡法检验各组基因频率，确认等位基因的分布有群体代表性。实验数据以(±s)表示，组间比较采用t检验及配对t检验；χ2检验进行组间多态性基因频率分析。相关回归分析PPARγ2基因Pro12Ala多态性与T及IR的相关性。取α=0.05为检验水准。

　　2 结果

　　2.1 两组的一般资料

　　PCOS组和对照组的年龄分别是(26.49±5.04)岁和(23.16±4.18)岁(P>0.05)，BMI为(23.2±4.03)kg/m2和(21.84±2.57)kg/m2(P>0.05)。T水平：PCOS组>对照组[(2.34±0.73)nmol/L，(1.02±0.43)nmol/L，P<0.05]。PCOS组T水平，P/A组

　　2.2 罗格列酮的临床疗效与PPARγ2基因型的关系

　　罗格列酮组，46例PCOS患者均为P/P型基因。用药期间或停药后，27例排卵，12例妊娠，排卵率58.7%，妊娠率26.1%，与用药前相比，T浓度下降(P<0.05)，FIns水平明显下降(P<0.05)，ISI升高(P<0.05)；AUCIns降低(P<0.05，表1)。表1 罗格列酮用药前后PCOS患者的血液生化指标及睾酮水平（略）

　　2.3 PPARγ2基因Pro12Ala基因型、Ala12等位基因的频率分布
　　
　　PCOS组和对照组的基因型均以P/P纯合子最多见，未见A/A纯合子，基因分布符合HardyWeinberg平衡定律。285名研究对象中，P/A基因型频率为6.3%，Ala等位基因频率为3.2%。PCOS组和对照组的P/A基因型频率分别为6.7%和5.9%(P>0.05)。两组Ala等位基因频率分别为3.3%和3.0%(P>0.05，表2、图1)。表2 PCOS患者Pro12Ala基因型、Pro和Ala等位基因的频率分布（略）
　　
　　PCOS组PPARγ2基因Pro12Ala多态性基因型和等位基因频率与文献报道的其他国家比较，PPARγ2基因Pro12Ala多态性基因型以P/P为主，明显低于德美人群(P<0.05，表3)。表3 不同国家PPARγ2基因Pro12Ala基因型、Ala及Pro等位基因频率的比较（略）

　　2.4 PCOSIR组和NIR组PPARγ2基因型及等位基因频率的比较
　　
　　PCOSIR组和PCOSNIR组：PPARγ2Pro12Ala基因型频率分别为5.1%和7.7%(χ2=0.845，P>0.05)；Ala等基因频率分别为2.6%和3.9% (χ2=0.391，P>0.05)。P/P组和P/A组PCOS患者FIns分别为14.1mu/L和11.3mu/L(P>0.05，表4)。表4 IR组和NIR组PPARγ2基因Pro12Ala基因型、Ala和Pro等位基因的频率分布（略）

　　2.5 PPARγ2的Pro12Ala多态性与肥胖、T及胰岛素抵抗的相关性

　　以PPARγ2Pro12Ala变异频率为自变量，ISI 、BMI、T为因变量行相关回归分析，结果显示T与PPARγ2Pro12Ala变异频率呈负相关(r=-0.91，P<0.05)，T与FIns呈正相关(r=0.69，P<0.01)。

　　3 讨 论

　　PCOS是一种发病多因性、临床表现多样性、遗传异质性、家族聚集性的内分泌代谢异常性疾患，以雄激素过多及持续无排卵为临床特征。胰岛素抵抗是其病理生理学基础，发病机制尚未阐明。PPARγ是调节胰岛素敏感性的重要因子，其人工配体罗格列酮，用药后未能改善部分PCOS患者的生殖障碍[2]，表明罗格列酮临床疗效的异质性。因此，有必要探讨PCOS患者PPARγ2基因Pro12Ala多态性与罗格列酮疗效及PCOS发病的关系。

　　3.1 PPARγ2Pro12Ala多态性与PCOSIR的关系

　　雄激素过多是PCOS引起无排卵性不孕的重要原因。高水平雄激素形成机制主要是由于LH分泌过剩、IR和高胰岛素血症。研究表明，高胰岛素作用于卵巢的卵泡膜细胞，细胞色素P450c17α酶活性增加，加速孕酮转化为17α羟孕酮，再转化为雄烯二酮和睾酮[7]；高胰岛素抑制肝脏合成性激素结合球蛋白，使游离睾酮水平升高[7]；高胰岛素并增加肾上腺对促肾上腺皮质激素的敏感性，使肾上腺产生过多脱氢表雄酮，后者通过3β羟基类固醇脱氢酶Ⅱ转化为T[7]。高雄激素又加重IR，形成PCOS持续性不排卵的恶性循环。
　　
　　本研究发现：① PCOS组T水平P/A组

　　3.2 罗格列酮疗效与PPARγ2Pro12Ala多态性的关系

　　PPARγ是一类核转录因子，参与脂肪细胞分化及糖、脂代谢[8]。罗格列酮是PPARγ的一种人工配体，与PPARγ结合后，进而与维甲酸类受体X(RXR)或糖皮质激素受体形成异二聚体，再结合于特异的DNA序列而促使靶基因活化，调节胰岛素相关基因的转录，增加机体对胰岛素的敏感性[10]。研究证实罗格列酮通过改善IR，恢复PCOS生殖功能，提示PPARγ基因在PCOS发病机制中起重要作用[11]。但是，PPARγ2基因Pro12Ala多态性在PCOS发病机制中的作用如何，能否预测罗格列酮的临床疗效尚不清楚。本研究结果表明：罗格列酮组的46例PCOS患者均为P/P型基因，用药后T浓度下降，ISI升高，证明罗格列酮通过PPARγ基因改善IR，恢复卵巢排卵功能。但是，仍有约40%(19/49)PP型基因的PCOS患者仍未排卵，表明罗格列酮改善PCOS患者卵巢功能的临床疗效的异质性与PPARγ2Pro12Ala多态性可能无直接关系。

参考文献

　　[1]Majuri A， Santaniemi M， Rautio K， et al. Rosiglitazone treatment increases plasma levels of adiponectin and decreases levels of resistin in overweight women with PCOS: a randomized placebocontrolled study [J]. Eur J Endocrinol， 2007， 156(2):263269.

　　[2]Zheng JH， Cao ZS. Effect of rosiglitazone and metformin on clomiphene citrate resistance in women with polycystic ovary syndrome [J]. AJXJTU， 2005， (17)1:6265.

　　[3]Geisthvel F. A comment on the European Society of Human Reproduction and Embryology /American Society for Reproductive Medicine consensus of the polycystic ovarian syndrome [J]. Repeod Biomed online， 2003， 7(6):602605.

　　[4]傅茂，程桦，李秀均，等. 过氧化物酶增殖体激活受体γ2基因Pro12Ala变异与2型糖尿病的关系 [J]. 中华医学遗传学杂志， 2002， 19(3):234238.

　　[5]Hara K， Okada T， Tobe K， et al. The Pro12Ala polymorphism in PPAR gamma may confer resistance to type 2 diabetes [J]. Biochem Biophys Res Commun， 2000， 271(1):212216.

　　[6]Herrmann SM， Ringel J， Wang JG， et al. Peroxisome proliferatoractivated receptor(2 Pro12Ala polymorphism is associated with nephropathy in type 2 diabetes: the berlin diabetes mellitus (BeDiaM) study [J]. Diabetes， 2002， 51(8):26532657.

　　[7]Wertheim K， SobczynskaTomaszewsks A， Bal J. Search for the ethiopathogenesis of polycystic ovary syndrome (PCOS) [J]. Ginekol Pol， 2007， 78(8):626631.

　　[8]Yilmaz M， Ergün MA， Karakoc A， et al. Pro12Ala polymorphism of the peroxisome proliferatoractivated receptorgamma gene in women with polycystic ovary syndrome [J]. Gynecol Endocrinol， 2006， 22(6):336342.

　　[9]Antoine HJ， Pall M， Trader BC， et al. Genetic variants in peroxisome proliferatoractivated receptor gamma influence insulin resistance and testosterone levels in normal women， but not those with polycystic ovary syndrome [J]. Fertil Steril， 2007; 87(4):862869.

　　[10]Seda O， Sedova L， Oliyarnyk O， et al. Pharmacogenomics of metabolic effects of rosiglitazone [J]. Pharmacogenomics， 2008， 9(2):141155.

　　[11]Unluturk U， Harmanci A， Kocaefe C， et al. The genetic basis of the polycystic ovary syndrome: a literature review including discussion of PPARgamma [J]. PPAR Res， 2007， 1155:2345.