电针对糖尿病大鼠学习记忆及海马结缔组织生长因子表达的影响

　　　　 作者：马萍，纪中，于航，楚玉荣

【摘要】 目的 观察电针对糖尿病性认知功能障碍大鼠学习记忆的改善作用及其对海马结缔组织生长因子(connective tissue growth factor， CTGF)mRNA和蛋白表达的影响。方法 采用腹腔注射20g/L链脲佐菌素(streptozotocin， STZ)构建糖尿病大鼠模型，将模型大鼠随机分为电针组(EA)、模型组(DM)、正常组(CN)。电针4周后测定大鼠血糖水平，应用Morris水迷宫法观察电针对糖尿病大鼠学习记忆的影响，并用RTPCR和免疫组化方法检测海马CTGF mRNA和蛋白表达水平。结果 模型组血糖、上台潜伏期高于正常组和电针组(P<0.01)，模型组CTGM mRNA和蛋白表达明显低于正常组和电针组(P<0.01)。结论 电针能在一定程度上降低血糖，促进海马CTGF mRNA和蛋白表达，改善糖尿病认知功能障碍者的学习记忆和认知功能。

【关键词】 电针；血糖；学习记忆；海马；结缔组织生长因子

　　ABSTRACT: Objective To observe the effect of electroacupuncture on improvement of learning and memory ability and the expression of connective tissue growth factor (CTGF) mRNA and protein in hippocampus in diabetic rats with cognitive impairment. Methods The rat diabetes model was induced by injecting streptozotocin (20g/L)， and then the rats were randomly pided into three groups: electroacupuncture group (EA)， diabetesmellitusuntreated group (DM) and control group (CN). After four weeks of electroacupuncture treatment， blood glucose level was determined and the effect of electroacupuncture on learning and memory was examined with the device of Morris water maze. RTPCR was used to detect CTGF mRNA level， and immunohistochemistry was used to detect CTGF protein expression. Results Blood glucose level and the latency period in DM group were increased compared with those in EA and CN groups (P<0.01). The expression of CTGF mRNA and the protein in DM was decreased compared with that in EA and CN groups (P<0.01). Conclusion Electroacupuncture can decrease blood glucose level， increase the expression of CTGF， and improve the learning and memory ability in diabetic rats with cognitive impairment.

　　KEY WORDS: electroacupuncture; blood glucose; learning and memory; hippocampus; connective tissue growth factor (CTGF)

　　学习记忆障碍是糖尿病常见的慢性并发症，己成为影响患者生活质量的主要原因之一。糖尿病患者中枢系统的损伤受多种因素影响，发病机制尚未完全阐明。研究表明，多种细胞因子参与此损伤过程。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor， CTGF)是近年新发现的一种多功能生长因子，在多种生物学过程中起重要作用。为探讨电针对糖尿病大鼠学习记忆障碍的改善及对海马CTGF表达的影响，本文研究了链脲佐菌素(streptozotocin， STZ)诱发实验性糖尿病大鼠海马组织中CTGF表达及电针刺激对其学习记忆的影响。

1 材料与方法

　　1.1 动物 雄性Wistar大鼠50只，体重200～250g，购自哈尔滨医科大学第一附属医学院实验动物中心，合格证号：黑动字第P00102008号。

　　1.2 方法

　　1.2.1 模型建立 随机选择10只大鼠为正常组(CN)，腹腔注射等量的柠檬酸柠檬酸钠缓冲液。其余40只大鼠用于糖尿病模型构建，具体方法：禁食24h后按60mg/kg体重腹腔注射用柠檬酸柠檬酸钠缓冲液新鲜配制的20g/L链脲佐菌素溶液(STZ)，1周后测定血糖，凡血糖值≥16.7mmol/L者为糖尿病大鼠。12周后造模成功26只，随机分为模型组(DM)13只和电针组(EA)13只，治疗过程中模型组有4只大鼠死亡，电针组有3只大鼠死亡。

　　电针取穴参照《实验针灸学》[1]，大鼠百会穴在顶骨正中，大椎穴在第7颈椎与第1胸椎棘突之间，背部膀胱经第1侧线位于脊柱正中旁开5mm。用30号1寸毫针，沿皮斜刺百会、大椎穴，刺入0.5寸，接G6805型电针仪，通以疏密波，频率14～26次/min，强度以大鼠耳廓轻微颤动为度(约30mA)。每次电针15min，隔日1次，连续4周。

　　1.2.2 Morris水迷宫实验 白色圆形水池直径为120cm，高60cm，平台高40cm，平台直径10cm。水池等分4个象限，任一象限放置平台。水深42cm，加入奶粉使水显乳白色。大鼠每天上、下午各训练1次，连续2周。90s仍未找到平台者，则将其放置于平台上站立10s。第2周到第4周每间隔1d后上午将大鼠从平台正对的象限入水，测定每只大鼠学习能力。观察指标为：观察90s内找到平台的时间(上台潜伏期)。

　　1.2.3 免疫组化及RTPCR实验 4周末乙醚麻醉下眶后静脉采血，待查血糖。处死动物，开颅取出脑，用等渗生理盐水清洗去水后迅速将大脑海马组织放入液氮中速冻，置―70℃冰箱中保存备用。选取5μm厚海马冠状切片，CTGF免疫组织化学染色(ABC法)。石蜡切片脱蜡、水化，PBS冲洗，30mL/L h3O2以阻断内源性过氧化物酶活性，一抗用兔抗鼠的CTGF(1∶100)，二抗用羊抗兔IgG(1∶200)，DAB显色，苏木精复染，脱水、透明，封片。每个标本随机取6张切片，每张切片随机选6个区域，每个区域面积为200μm，计数每个区域阳性细胞数，取平均值统计数据。

　　取速冻大鼠海马约100mg，按Trizol试剂说明书方法提取总RNA。取1μg进行RTPCR反应。PCR CTGF引物序列[2]分别为上游5′CTAAGACCTGTGGAATGGGC3′；下游5′CTCAAAGATGTCATTGCCCCC3′(扩增片段长383bp)。同时扩增βactin[2]，其引物序列分别为上游5′GTGGGCGCTCTAGGCACCAA3′；下游5′CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC3′(扩增片段长540bp)。PCR变性、退火和延伸温度分别为94℃、55℃和72℃，反应时间分别为45s、45s和60s，共进行30个循环。循环完毕再72℃延伸10min。PCR产物用20g/L琼脂凝胶电泳分析，电泳后在紫外灯下拍照，用Tanon GIS1000凝胶成像处理系统对每一标本的PCR扩增的特异性片段进行灰度扫描，以βactin密度作为参考定量标准，数值以两者吸光度的比值表示，以对照组的比值作为标准1.0。

　　1.2.4 图像分析及数据处理 数据用±s表示。应用SPSS11.0软件进行统计分析，数据呈正态分布，方差齐性，多组组间比较采用多因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结　　果

　　2.1 电针对血糖的影响 电针组经电针刺激糖尿病大鼠，可致其血糖浓度下降，电针治疗前后有显著性差异(P<0.01，表1)。表1 各组大鼠的血糖含量

　　2.2 电针对学习记忆的影响 模型组[(70.85±8.62)s]的上台潜伏期较正常组[(31.91±2.42)s]明显延长(P< 0.01)。电针组[(39.05±7.93)s]的上台潜伏期较模型组明显缩短(P<0.05)，与正常组相比，其上台潜伏期仍较长，但两者之间无显著性差异(P>0.05)。

　　2.3 电针对大鼠海马CTGF mRNA及蛋白表达的影响 正常组大鼠海马组织中CTGF mRNA和蛋白均有表达，模型组大鼠海马CTGF mRNA表达及蛋白表达阳性细胞均明显减少(P<0.01)，经电针治疗4周后大鼠海马CTGF mRNA表达及蛋白表达阳性细胞显著高于模型组(P<0.0l，表2、图1、图2)，表明CTGF在DM大鼠学习记忆障碍的发生、发展中起着极其重要的作用。表2 各组大鼠海马CTGF mRNA及蛋白的表达

3 讨　　论

　　CCN基因为新发现的一个基因家族，包括CTGF、Cyr61(cysteinerich 61)、肾母细胞瘤过度表达基因(nephroblastoma overexpressed gene)等。其中，CTGF能与靶细胞表面受体结合，通过胞饮方式纳入内涵体，移位至胞质，由蛋白激酶C磷酸化，转运至胞核周围，通过激活蛋白激酶或直接影响细胞的转录而诱导相关基因表达和mRNA的产生。根据靶细胞种类的不同，CTGF具有不同的生物学效应：如促进细胞有丝分裂和成纤维细胞增殖、合成胶原[3]，促进细胞外基质沉积[45]，介导细胞黏附[6]和趋化作用[7]，诱导细胞凋亡[8]，促进血管形成等。

　　CTGF基因的表达首先在低级中枢出现，然后向高级中枢发展，此与中枢神经系统的发育、分化相一致。研究发现CTGF是神经系统发育和分化所必须的调控因素，可能在神经系统功能分化及维持神经系统生理功能中起重要作用。在出生前，免疫组化检测大鼠中枢神经系统未见CTGF阳性表达细胞。出生后早期较少，生后1～2月间阳性细胞数最多，分布广泛，阳性信号强。随年龄的增长阳性细胞数量逐渐降低，分布范围逐渐减小。阳性细胞主要分布于大脑的扣带皮质、海马、下丘脑等处。这些区域属于边缘系统，从已知的功能看，边缘系统主要与内脏功能调节、情绪行为和记忆有关。

　　本研究发现正常大鼠海马中细胞CTGF mRNA和蛋白均有表达，而糖尿病大鼠CTGF mRNA和蛋白表达明显减少。水迷宫实验发现模型组的上台潜伏期较正常组明显延长(P<0.01)，模型组有明显学习记忆障碍。电针刺激后，电针组CTGF mRNA和蛋白表达增强，电针组的上台潜伏期较模型组明显缩短(P<0.05)。提示CTGF表达增强对糖尿病大鼠海马具有保护作用，并能明显改善糖尿病大鼠的学习记忆能力。

　　血糖增高和多种理化因素[9]及负向调节的JNKMAPK、cAMP/PKA途径参与对CTGF表达的调节[10]，对糖尿病大鼠海马CTGF表达的调节作用还需进一步研究。

　　针刺百会、大椎等可调节中枢神经系统的兴奋性，从而调节下丘脑垂体胰岛轴的功能，增强胰岛素受体的敏感性，提高β细胞葡萄糖受体对葡萄糖敏感性。电针治疗能使胰岛β细胞再生能力明显增强，数量增多，加快受损β细胞的修复使其分泌的胰岛素增加，从而能有效地降低血糖，达到治疗糖尿病的目的[11]。

　　目前认为，电针治疗是根据脑的可塑性和功能重组理论，利用中枢神经细胞的重组达到预防糖尿病中枢神经系统的损伤。本研究中也证实了电针治疗能显著增加糖尿病大鼠海马CTGF的表达，提高其学习记忆。进一步研究电针作用机制，有望为糖尿病及并发症治疗提供新的理论依据。

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