改良骨骼肌肌纤维分型ATP酶染色方法

　　　　 作者：章涛，张潜，胡锡阶，薛黔，陈代雄

【摘要】 目的 采用经作者改良的GuthSamaha肌球蛋白ATP酶染色方法，观察其对大鼠骨骼肌肌纤维分型染色效果。方法 取8μm厚度SD大鼠胸肌及肱二头肌冰冻切片，用含40g/L多聚甲醛固定液固定5min；Tris洗液漂洗后置预孵育液中室温下孵育15min；Tris洗液中漂洗2次，置孵育液中于37℃恒温水浴摇床中振摇孵育60min；10g/L氯化钙洗3次后置20g/L氯化钴液中3min；蒸馏水冲洗，于10g/L硫化铵液中孵育3min；自来水冲洗3min，常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，置显微镜下观察。结果 SD大鼠胸肌和肱二头肌经改良GuthSamaha肌球蛋白ATP酶染色后均可清晰地显示出明亮色白的Ⅰ型纤维和幽暗深褐的Ⅱ型纤维。结论 改良GuthSamaha肌球蛋白ATP酶染色方法具有试剂配制简单、操作简化和肌纤维分型效果满意等优点，值得在骨骼肌相关研究中借鉴应用。

【关键词】 肌球蛋白ATP酶；肌纤维型；大鼠

　　ABSTRACT: Objective To study the effect of selfmodified Guth & Samahas myosinATPase staining method on the classification of SD rat skeletal muscle fiber types. Methods 8μmthick cryostat sections from rat chest muscles and biceps brachii muscles were transfected with cryostat. MyosinATPase staining was carried out according to the following procedure: ① Fixing sections for 5min in fixative solution containing 40g/L paraformaldehyde; ② Rinsing slides in Trisrinse solution and then preincubating them in alkaline preincubation solution for 15min; ③ Rinsing slides in Trisrinse solution twice and then incubating them for 60min in incubation solution; ④ Washing slides for three times in 10g/L CaCl2 and then placing them in 20g/L CoCl2 for 3min; ⑤ Washing sides in distal water and then placing them in 10g/L (NH4)2S for 3min and; ⑥ Washing slides in running tap water for 3min， dehydrating in graded ethanol， clearing in xylene and mounting in neutral balsam. Results After being stained by modified myosinATPase staining method， both chest muscle and biceps brachii muscle samples from SD rats could be clearly identified as type Ⅰ fibers and type Ⅱfibers as the fibers of type Ⅰ were stained white while the fibers of type Ⅱ were stained brown. Conclusion Modified myosinATPase staining method is a simple and effective way for muscle fiber type classification and can be applied in skeletal muscle related study.

　　KEY WORDS: myosin ATPase; muscle fiber types; rat

　　 GuthSamaha肌球蛋白ATP酶染色骨骼肌纤维分型方法于上世纪70年代建立以来，已成为骨骼肌功能相关研究的重要手段之一[1]。该方法的应用极大地推动了骨骼肌相关研究的深入与发展。由于岁月的变迁，原GuthSamaha肌球蛋白ATP酶染色方案中所采用的特定缓冲溶液产品已停止生产，其配方也无从知晓，限制了该方法的推广应用。这或许是目前骨骼肌分型研究报道不多的原因之一。探寻更为简便、适用的肌球蛋白ATP酶染色方法对骨骼肌的相关研究具有现实意义。本研究采用自行改良的GuthSamaha肌球蛋白ATP酶染色方法，对大鼠来源骨骼肌进行肌纤维分型染色，取得了满意的染色分型效果。

1 材料与方法

　　1.1 实验动物与试剂 成年SD大鼠10只，雌雄不拘，体重250～300g，由第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供。Tris碱、二甲胂酸钠为进口分装产品，多聚甲醛、无水氯化钙、蔗糖、氯化钾、ATPDisodium、氯化钴、硫化铵、乙醇、二甲苯等均为国产分析纯试剂。

　　1.2 溶液配制 以GuthSamaha[1]液体配制方案为基础经改良后进行，固定液由原方案20mL/L甲醛溶液调整为40g/L多聚甲醛溶液；由于文献中使用的Sigma No.221 buffer现已停产，其配方也不清楚，故本实验中采用自行摸索出的0.2mol/L的Tris碱溶液配制预孵育液和孵育液。全部试剂按如下配方新鲜配制使用。

　　固定液：多聚甲醛10g，二甲胂酸钠8g，无水氯化钙2.5g，蔗糖28.8g，加水250mL；6mol/L HCl调pH值至7.6；Tris洗液：Tris碱12.1g，0.18mol/L CaCl2 100mL，加纯水900mL，6mol/L HCl 调pH值至7.8；预孵育液：Tris碱 6.150g，0.18mol/L CaCl2 25mL，加纯水225mL，6mol/L HCl 调pH值至10.4；孵育液：Tris碱 7.420g，0.18mol/L CaCl2 30mL，KCl 1.110g，18mmol/L ATPDisodium 46mL，加纯水225mL，6mol/L HCl调pH 至9.4；10g/L硫化铵：(NH4)2S 0.6mL，加纯水60mL；20g/L氯化钴：CoCl2 1g，加纯水50mL；10g/L氯化钙：CaCl2 10g，加纯水1000mL。

　　1.3 取材和组织切片 10g/L戊巴比妥钠(40mg/kg体重)麻醉大鼠后，取10只SD大鼠2侧共20块胸肌和肱二头肌，自肌腹部切取约5mm长的组织块，迅速将新鲜肌块放入恒冷切片机内(Leica CM3050S)，-20℃下切片，厚度为8μm，切片于室温下干燥30min后，进行肌球蛋白ATP酶组织化学染色。

　　1.4 改良肌球蛋白ATP酶组织化学染色 以GuthSamaha[1]肌球蛋白ATP酶组织化学染色方案为基础经改良后进行骨骼肌纤维分型染色。实验流程为：取上述干燥的冰冻切片于固定液中固定5min；Tris洗液漂洗1min，在滤纸上将多余液体沾干后置预孵育液中室温下孵育15min；Tris洗液中漂洗2次，每次1min，并在滤纸上将多余液体沾干；置37℃孵育液中，于恒温水浴摇床中振摇孵育60min；10g/L CaCl2洗液洗3次，每次30s，沾干后置20g/L氯化钴液中3min；蒸馏水冲洗2min，置10g/L硫化铵液中3min；自来水冲洗3min，镜检后常规梯度乙醇脱水(700mL/L乙醇 2min，800mL/L乙醇2min，950mL/L乙醇2min，1000mL/L乙醇6min，1000mL/L乙醇8min)，二甲苯透明，中性树胶封片，置显微镜下观察，图像分析仪上随机选点摄片，每张切片共计数两型肌纤维500条以上，计算2型肌纤维比例。

　　1.5 统计学处理 结果以均数±标准差(±s)表示，采用SPSS13.0软件包对实验数据进行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结　　果

　　2.1 改良肌球蛋白ATP酶组织化学染色效果 大鼠胸肌与肱二头肌冰冻切片经改良的肌球蛋白ATP酶组织化学染色后均可清楚地显示Ⅰ、Ⅱ型纤维，其中Ⅰ纤维明亮色白，Ⅱ型纤维则呈深褐色，2种肌纤维在肌内呈棋盘样分布，Ⅰ、Ⅱ型纤维对比明显(图1)。

　　2.2 大鼠胸肌和肱二头肌的肌纤维型组成 图像分析仪计数结果表明，大鼠胸肌的Ⅰ、Ⅱ型纤维比例分别为(44.4±5.7)%和(55.6±6.3)%，两者比较差异无统计学意义(P>0.05)；而肱二头肌则相应为(14.3±2.4)%和(85.7±5.0)%，以Ⅱ型纤维占绝对优势(P<0.01)。并且胸肌的Ⅰ型纤维构成比例高于肱二头肌(P<0.01)。

3 讨　　论

　　骨骼肌肌纤维型构成与肌的功能密切相关，肌纤维型的组成与分布是阐明骨骼肌功能的重要依据之一。研究表明，人和动物单个骨骼肌纤维的酶活性存在极大的差异，基于酶组织化学的研究，可以确定所有人骨骼肌至少含有2种类型的肌纤维，即Ⅰ型纤维和Ⅱ型纤维[2]。Ⅰ型纤维含有高浓度的氧化酶类如琥珀酸脱氢酶，涉及有氧代谢，而Ⅱ型纤维含有高浓度的糖酵解酶如磷酸化酶，其主要涉及无氧代谢。目前为止，用于确定骨骼肌肌纤维型的方法主要包括肌球蛋白ATP酶染色[3]和肌球蛋白重链免疫组织化学亚型分类法[4]。肌球蛋白ATP酶染色方法因不需要专用抗体，肌纤维染色结果清晰直观，因而一直被研究者采用。GUTH和SAMAHA[1]于上世纪70年代首次系统地提出了肌球蛋白ATP酶酸碱孵育法，在孵育前分别将冰冻切片置于碱性(pH 10.4)或酸性溶液(pH 4.35)中预孵育，由于Ⅰ型纤维的ATP酶活性小、遇碱不稳定，Ⅱ型纤维ATP酶活性大、遇碱稳定，通过控制预孵育液的pH值可将2种不同的骨骼肌纤维区分开来。

　　研究表明，个体内不同骨骼肌的肌纤维型构成比例不同[56]。从生物化学和骨骼肌生理学的角度可以解释2种骨骼肌肌纤维差异的内在原因：Ⅰ型纤维以有氧代谢为主要获能方式，其主要参与耐力运动和维持肢体姿势，也称为慢缩纤维或慢缩氧化型纤维；而Ⅱ型纤维主要以无氧酵解提供能量，主要提供快速运动和力量保障，也称快缩纤维或快缩糖酵解型纤维[7]。新近的研究发现，运动锻炼或病理状态下的骨骼肌肌纤维型组成均可发生变化[89]。本研究结果表明，2型肌纤维在大鼠胸浅肌内呈棋盘样均匀分布，且比例对等，这表明大鼠胸浅肌为耐力兼速度的复合功能型肌，其功能上除了呼吸运动外，还参与机体的快速、爆发性运动。而大鼠肱二头肌以Ⅱ型纤维为主，达到(85.7±5.0)%，说明其主要参与力量和速度运动，其Ⅰ型纤维比例仅为(14.3±2.4)%，明显不及狗、马Ⅰ型纤维的比例(分别为48%，32%～66%)[10]，这可能与较大动物的前肢比小型动物更多的参与保持站立位姿势有关。可见，就有关各种骨骼肌的肌纤维组成与分布研究对揭示其功能特点具有重要意义，探寻可操作性强、简便稳定且重复性好的骨骼肌纤维分型染色方法很有必要。

　　在探寻更为简便、适用的肌球蛋白ATP酶染色方法过程当中，作者发现，采用原方案20mL/L甲醛固定染色后的肌纤维界限模糊，而改用含40g/L多聚甲醛固定液固定能很好地解决这一问题。对原方案预孵育液及孵育液中添加的不明配方缓冲液成分，我们改用适量浓度的Tris碱液代替，此外，还对原方案20g/L氯化钴液孵育后进行的pH为9.4的碱性洗液漂洗(配方不明)调整为蒸馏水冲洗2min。经上述改良的肌球蛋白ATP酶组织化学染色法可清楚地显示大鼠骨骼肌Ⅰ、Ⅱ型纤维，且两型纤维对比明显，同一视野下的肌纤维分型染色切片其脱水前后的染色结果对应一致，表明梯度乙醇和二甲苯等有机溶剂不会改变和影响该方法的肌纤维染色结果。

　　需要强调的是，设定恰当的预孵育液pH值至关重要。由于不同物种骨骼肌其肌球蛋白ATP酶的pH值稳定性存在差异，因此，本文所采用的pH值仅供使用者作为参考，研究者须根据特定的研究对象，在实验中确定其最适pH值及预孵育时间，以求获得最佳的染色分型效果。

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