桂枝茯苓丸对荷瘤鼠P21waf/cip基因表达的影响

　　　　　　 作者：王琪，马新博，蔡文辉，王亚贤

【摘要】 目的 探讨桂枝茯苓丸诱导肿瘤细胞凋亡的机制，为桂枝茯苓丸(GFW)开发应用提供实验依据。方法 计算抑瘤率，流式细胞仪测定细胞凋亡率，免疫组化法测定P21waf/cip蛋白表达，原位杂交法检测Survivin mRNA表达，电镜观察肿瘤细胞超微结构。结果 GFW抑瘤率为38.93%，流式细胞仪检测GFW组凋亡率17.79%，与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。GFW上调肿瘤细胞P21waf/cip蛋白表达，下调Survivin mRNA表达。GFW组镜下可见瘤细胞以凋亡变化为主。内膜结构完好，核膜清晰，细胞核固缩，染色质团块状散布核内或边集核膜下，并可见凋亡小体。结论 GFW诱导肿瘤细胞凋亡，其机制可能与上调P21waf/cip及下调Survivin mRNA表达密切相关。

【关键词】 桂枝茯苓丸；P21waf/cip；生存素；凋亡

　　Chinese Traditional Medicine， Harbin 150040， China)ABSTRACT: Objective To study the effect of Guizhi Fuling Wan (GFW) on tumor apoptosis and apply the experimenting basis of GFWs development and utilization. Methods The S180 mice sarcoma model was used to detect the inhibitory effects of GFW， observe the ultrastructural change by electron microscopy， and the flow cytometer was used for apoptosis determination. The protein expression of P21waf/cip and the mRNA expression of Survivin were evaluated by immunohistochemistry and in situ hybridization. Results For S180 sarcoma， the inhibition ratio of GFW was 38.93%. The apoptosis was 17.79% by the flow cytometer. Some typical apoptotic cells and apoptotic bodies were observed through electron microscope. Chromatin gathered at the side of cell， the nucleus turned into the nucleus band and nucleus projected. Survivin mRNA markedly declined in the GFW group when compared with that in the model group (P<0.01)， while the postitive expression of P21waf/cip was obviously higher in the GWF group than in the model group (P<0.01). Conclusion GFW induces tumor cell apoptosis， the mechanism of which may be closely related to adjusting expression level of P21waf/cip and Survivin gene.

　　KEY WORDS: Guizhi Fuling Wan (GFW); P21waf/cip; Survivin; apoptosis

　　中医认为血瘀是肿瘤的主要成因之一。桂枝茯苓丸(Guizhi Fuling Wan， GFW)是一种活血化瘀方剂，广泛用于各种血淤症的治疗，临床实践证明具有一定的抑瘤作用[1]。但是，对其抑瘤机制的研究并不深入。本文选用荷瘤小鼠作为研究对象，观察GFW对肿瘤细胞的诱导凋亡作用及对P21waf/cip、Survivin表达的影响，以期从分子水平上探讨GFW抗肿瘤的机制，为GFW的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

　　1.1 主要仪器和试剂 P21waf/cip单抗、免疫组化染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；原位杂交试剂盒购自天津灏洋生物技术有限公司。Olympus显微镜(日本)、HITACHIH500型透射电镜(德国菲利蒲公司)、Facscalibur流式细胞仪(美国BD公司)、SB651旋转蒸发仪(日本RIKAKI公司)和HIMAS2000多媒体彩色病理图文分析系统(齐齐哈尔医学院中心实验室所有)。

　　1.2 实验动物 40只昆明小鼠，体重(20±2)g，雄性，由齐齐哈尔医学院实验动物中心提供。

　　1.3 瘤株 S180瘤株由黑龙江省肿瘤研究所提供。

　　1.4 药物 桂枝茯苓丸按《金匮要略》记载标准，生药均购自黑龙江中医药大学附属医院。桂枝、茯苓、桃仁、牡丹皮、赤芍各药等量，加适量水，浸泡2h，先文火后武火煎煮两次，经过滤除渣后，水浴浓缩，配成1g/mL的水煎剂，置4℃保存备用。环磷酰胺(cylophosphamide， CY)系山西普德药业有限公司出品，批号H14023686。

　　1.5 动物模型 取腹腔接种7d的荷瘤小鼠，在无菌条件下抽取腹水(乳白色，黏稠)，放入无菌容器内，置冰块保存。4g/L台盼蓝生理盐水液计数(计活细胞大于95%)，生理盐水调细胞浓度至5×106/mL。取昆明小鼠30只，每只鼠右侧腋下皮下注射0.2mL瘤细胞悬液。

　　1.6 动物分组及给药方法 将荷瘤鼠随机分为3组，每组10只，分别为模型组、实验组和CY组，另取10只未荷瘤小鼠作为正常对照。模型组(model group)：生理盐水灌胃20mL/(kg·d)；中药组(GFW group)：GFW 灌胃20mL/(kg·d)[2]；环磷酰胺组(CY group)：腹腔注射CY 20mg/(kg·d)。接种后次日给药，各组每天给药1次，连续10d。

　　1.7 细胞凋亡率的检测 给药10d后，小鼠脱颈处死，无菌取腋下实体瘤，常规制备瘤细胞悬液，调整浓度1×106/mL，1500r/min离心5min，弃上清，PBS洗1次，加700g/L冷乙醇1mL，4℃固定30min。离心5min，弃上清，PBS洗2次。加50g/L PI染液600mL染色，30min后上机测定。

　　1.8 透射电镜观察形态学改变 每组随机取两块瘤组织，将瘤组织快速投入戊二醛固定液固定2h以上，磷酸缓冲液漂洗，10g/L锇酸后固定1～2h，缓冲液漂洗20min，丙酮梯度脱水，浸透、包埋、制备超薄切片，醛酸双氧铀和柠檬酸铅染色，电镜观察并拍片。

　　1.9 免疫组化法检测P21waf/cip 瘤组织切片常规脱蜡至水，30mL/L h3O2室温封闭10min，蒸馏水冲洗，PBS洗，0.1mol/L枸橼酸缓冲液抗原微波修复，滴加封闭液，37℃ 20min，滴加1∶100稀释的P21waf/cip单抗4℃过夜，PBS洗，滴加生物素标记的二抗，37℃ 20min，PBS洗，滴加辣根酶标记链酶卵白素，37℃ 20min，PBS洗，DAB显色，苏木素复染，常规酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。PBS代替一抗作阴性对照。

1.10 原位杂交法检测Survivin mRNA 瘤组织及时固定，切片常规脱蜡至水。30mL/L h3O2室温封闭10min，PBS洗，暴露mRNA核酸片段，滴加预杂交液20μL，40℃ 3h，不洗，Survivin探针杂交液20μL，滴加40℃杂交过夜，杂交后洗涤，滴加生物素化抗地高辛37℃ 60min，原位杂交用PBS洗5min×4次，滴加高敏过氧化物酶链亲和素复合物工作液，37℃ 60min，原位杂交用PBS洗5min×4次，DAB显色，苏木素复染，常规酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。本实验设2张阴性对照片，1张用PBS代替探针，1张用PBS代替生物素化抗地高辛。

　　1.11 统计学方法 P21waf/cip、Survivin结果利用HIMAS2000多媒体全自动图像分析仪检测，所得数据经SPSS11.0系统处理，采用One Way ANOVA法，两两比较用SNK法。结果用±s表示，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结　　果

　　2.1 抑瘤率和肿瘤细胞的凋亡率 与模型组比较，GFW组、CY组瘤重显著低于模型组瘤重，差异有统计学意义(P<0.05)。GFW组与CY组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。GFW组抑瘤率为38.93%。GFW组肿瘤细胞的凋亡率为17.79%，与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。表1 GFW组、CY 组和模型组的抑瘤率和肿瘤细胞凋亡率的比较

　　2.2 肿瘤细胞的电镜观察结果 模型组瘤细胞的核浆比大，双层核膜清晰，核异形性明显，瘤细胞表面可见丰富微绒毛，胞质内线粒体轻度肿胀，核周可见幼稚高尔基复合体及内质网，游离核蛋白体丰富，有少量的淋巴细胞侵润。GFW组镜下可见瘤细胞以凋亡变化为主。瘤细胞体积明显变小，细胞表面的微绒毛减少甚至消失，内膜结构完好，核膜清晰，细胞核固缩，染色质团块状散布核内或边集核膜下，并可见凋亡小体。游离核蛋白体减少非常明显，线粒体嵴断裂，空泡变性，胞质内可见大量的脂肪堆积；同时可见大量粒细胞浸润并伴有坏死(图1)。

　　2.3 肿瘤细胞中P21waf/cip蛋白的表达和Survivin基因mRNA的表达 SP免疫组化方法染色后，P21waf/cip蛋白定位于胞核呈棕黄色(图2)，在10×40倍高倍镜下，每张标本随机选择5个视野，精确选取视野内所有的阳性颗粒，利用HIMAS2000多媒体图像分析系统，对各组P21waf/cip阳性细胞面密度值、阳性细胞平均灰度值进行分析。GFW组与CY组P21waf/cip蛋白阳性细胞面密度值、阳性细胞平均灰度值均高于模型组(P<0.01)。GFW组与CY组比较，P21waf/cip蛋白阳性细胞面密度值、阳性细胞平均灰度值差异无统计学意义(P>0.05)。提示GFW可上调肿瘤细胞内P21蛋白的表达(表2)。采用原位杂交法对Survivin基因mRNA表达进行半定量检测。染色结果显示Survivin基因表达定位于胞质呈棕黄色，弥漫性分布(图3)。在10×40倍高倍镜下，每张标本随机选择5个视野，精确选取视野内所有的阳性颗粒，利用HIMAS2000多媒体图像分析系统对Survivin各组原位杂交反应阳性细胞面密度值、阳性细胞平均灰度值进行分析。与模型组比较，GFW组和CY组Survivin基因mRNA表达降低(P<0.01)，GFW组与CY组比较，Survivin基因mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。提示GFW可下调肿瘤细胞内凋亡相关基因Survivin mRNA的表达(表2)。

3 讨　　论

　　细胞凋亡信号传导的大致过程是：细胞整合各种胞内外凋亡信号，通过细胞凋亡信号与其受体形成的复合物经胞浆信号转导蛋白传递至一组细胞凋亡的执行者caspase，再由激活的caspase对其特异性底物进行降解，最终导致细胞凋亡。通过应用各种不同的药物影响信号传导途径，从而触发或重建整个死亡程序，使处于关闭状态的凋亡信号传导各效应环节迅速连通，诱导程序化细胞死亡反应，为肿瘤治疗开辟了新思路[3]。本实验经流式细胞仪检测表明，GFW可促进荷瘤小鼠肿瘤细胞凋亡，凋亡率为17.79%。透射电镜观察GFW组瘤细胞以凋亡变化为主：瘤细胞体积明显变小，细胞表面的微绒毛减少甚至消失，内膜结构完好，核膜清晰，细胞核固缩，染色质团块状散布核内或边集核膜下，并可见凋亡小体。证明桂枝茯苓丸具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。

　　P21waf/cip是CDKI家族中具有代表性的蛋白，是目前已知具有最广泛活性的细胞周期抑制基因，同时又是促凋亡基因，其表达水平的提高，可阻止细胞的恶性增殖。P21waf/cip通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclindependent kinase， CDK)活性来控制细胞中G1期进入S期，并且抑制 PCNA活性[4]。SP免疫组化法染色结果显示，经GFW治疗后荷瘤鼠P21waf/cip表达增强，与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。说明桂枝茯苓丸能增强荷瘤鼠肿瘤细胞P21waf/cip表达；提示该中药组方可通过上调P21waf/cip表达而抑制CDK活性和PCNA活性，阻滞细胞从G1期向S期的进程，使细胞周期停滞于G1期，形成G1期阻滞，阻断肿瘤细胞的DNA合成和复制，最终发挥抑制肿瘤生长的作用。Survivin是凋亡抑制因子(inhibitor of apoptosis， IAP)家族的一个新成员．是目前发现的最强的凋亡抑制因子，广泛表达于各种肿瘤组织。Survivin可直接作用于caspase，主要抑制caspase 3和caspase 7的活性，阻断细胞凋亡[56]。Survivin也可通过P21waf/cip间接抑制caspase。Survivin与细胞周期调控因子CDK4结合形成SurvivinCDK4复合体使P21waf/cip从CDK4复合体中释放出来，P21waf/cip进而与线粒体caspase3结合，抑制其活性，阻断细胞的凋亡过程。Survivin还可通过促进细胞分裂而抑制细胞凋亡[7]。本实验应用原位分子杂交技术检测Survivin mRNA，结果显示Survivin mRNA在模型组中高表达。表明在肿瘤细胞中该基因转录功能增强，基因蛋白生成后，通过破坏凋亡平衡参与肿瘤细胞的发生发展。与模型组比较，GFW组Survivin基因mRNA表达降低(P<0.01)，表明GFW组具有下调凋亡抑制基因Survivin基因mRNA的转录水平的作用。

　　综上所述，桂枝茯苓丸可通过影响Survivin表达促进肿瘤细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞生长。GFW具有诱导肿瘤细胞凋亡作用，其分子机制与Survivin、P21waf/cip表达有关。本实验从Survivin、P21waf/cip的研究，提示桂枝茯苓丸可影响肿瘤细胞的基因水平，而肿瘤是多基因异常所致疾病，桂枝茯苓丸抑制肿瘤生长在基因水平的作用是对上述基因特异的作用，或是对多种癌基因和抑癌基因非特异作用还有待进一步的研究。

参考文献

[1]何秀兰，乔占兵，李忠. 中医治肝癌评述 [J]. 光明中医， 2002， 17(101):3740.

[2]徐叔云，卞如濂，陈修. 药理实验方法学 [M]. 第3版. 北京：人民卫生出版社， 2003:10541275.

[3]姚实林，许霞. 从凋亡相关基因水平探讨中药作用机制的研究思路 [J]. 中国中医基础医学杂志， 2004， 10(7):517519.

[4]郭湘云，马丽雅，刘晓霞. P53，P21waf/cip和Cyclin D1基因蛋白在沥青烟暴露小鼠肺组织中的表达 [J].环境与职业医学， 2008， 25(2):167171.

[5]吴永廉，郑建盛，蔡庆发，等. 胃癌组织中Survives、Bcl2、Bax蛋白的表达及意义 [J]. 第四军医大学学报， 2008， 29(14):12921294.

[6]徐虹，蒋东霞，胡杰英，等. 宫颈癌组织中Survivin和caspase3蛋白的表达 [J]. 郑州大学学报(医学版)， 2007， 42(2):462465.

[7]杜冠辉，谭金凤，吴淑金，等. Survivin与肿瘤的关系 [J]. 医学综述， 2008， 14(5):658660