应用甲状腺素片及饥饱失常法建立肝郁证大鼠模型的研究

　　　　 作者：刘素蓉，曹瑾，吴喜利，王志勇，王敏，高艳琼

【摘要】 目的 探讨建立中医肝郁证大鼠模型的一种新的造模方法。方法 依次采用甲状腺素片灌胃、饥饱失常法喂养，观察大鼠的行为学变化，测量大鼠肛温、并用夹心ELISA法检测其血浆五羟色胺(5hydroxytryptamine， 5HT)、去甲肾上腺素(norepinephrine， NE)、肾上腺素(epinephrine， E)水平的变化及逍遥散对其含量的影响。结果 肝郁模型组及逍遥散组大鼠于造模第28天均出现了典型的心肝火旺之症，体温均升高，与空白对照组相比有显著性差异(P<0.05)；于造模第44天，肝郁模型组大鼠血浆5HT、NE、E水平均较前明显升高(P<0.05或P<0.01)；且NE、E水平高于逍遥散组(P<0.01和P<0.05)；于造模第56天肝郁模型组出现典型的肝郁证的行为学特点，逍遥散组大鼠血浆中5HT水平低于肝郁模型组(P<0.01)。结论 应用甲状腺素片及饥饱失常法建立的肝郁证大鼠模型基本符合中医肝郁证的特征。

【关键词】 肝郁证；大鼠模型；逍遥散

　　ABSTRACT: Objective To study a new method of establishing the rat model of liver depression syndrome. Methods We adopted gasterpoured with thyroxine tablet and fullypoorly feeding food in turn， observed the praxiological changes of rats， measured the temperature in anus， chose the sandwich ELISA to detect the level change of 5hydroxytryptamine (5HT)， norepinephrine (NE)， epinephrine (E) in plasma and the effect of Xiaoyao Powder on change of their contents. Results From the 28th day after establishing the model， the rats both in the liverdepressed model group and the Xiaoyao Powder group showed typical symptoms of heat in the heart and liver. Compared with the blank control group， the temperature was increased significantly (P<0.05); at the 44th day of model establishment， in the liverdepressed model group， the level of 5HT， NE and E in rat plasma was higher than before (P<0.05 or P<0.01)， and the level of NE and E was lower than in the Xiaoyao Powder group (P<0.01 and P<0.05). At the 56th day， the typical characteristics of liverdepression syndrome appeared in the liverdepressed model group. The level of 5HT in the Xiaoyao Powder group was lowerer than in the liverdepressed model group (P<0.01). Conclusion The rat model of liverdepression syndrome has been initially established by the method of using gasterpoured with thyroxine tablet and irregularity of food， which is in compliance with the characteristics of liverdepression syndrome.

　　KEY WORDS: liverdepression syndrome; rat model; Xiaoyao Powder

　 辨证论治是中医学最显著的特点之一，而证候则是辨证论治的核心，它是以中医藏象理论为基础的。肝郁证是多因情志抑郁，或突然的精神刺激导致肝失疏泄、气机郁滞所表现的证候，在五藏证候中占有重要的位置。临床调查发现，中医肝病占五脏发病的39.6%，肝郁证及相兼证候则居其首，占肝病总数的41.9%，肝郁证是肝病证候的基本病理变化，是肝病证候的核心[1]。为了深入研究肝郁证形成的生物学基础从而更好的指导临床治疗，中医证候动物模型的建立在该研究中发挥着重要的作用。以往肝郁模型的造模方法主要有药物造模法、情志刺激法及多元素复合造模法三大类。目前，药物造模有艾叶注射法[2]、四氯化碳(CCl4)注射法[3]、肾上腺素皮下注射法[4]；情志刺激法有夹尾激怒打斗法[4]、捆绑法[4]、颈部带枷单笼喂养法[5]、慢性不可预知的多种应激刺激随机组合法[6]；多元素复合造模法主要为夹尾加肾上腺素注射法[7]。本研究首次通过依次给予甲状腺素片灌胃、定时限食限水(即饥饱失常法)的方法初步建立了肝郁大鼠模型，并进一步探讨该模型的某些生物学特征。

1 材料与方法

　　1.1 实验动物 青春期健康雌性SD大鼠30只，体重(200±10)g，动物饲料为普通固体饲料，均由西安交通大学医学院实验动物中心提供，在西安交通大学医学院生理实验室饲养、观察、研究。实验室温度(20±3)℃，湿度(55±5)℃，12h照明并通风。

　　1.2 药物与试剂 逍遥散按宋朝《太平惠民和剂局方》的记载，由柴胡12g，白术10g，茯苓10g，当归10g，白芍10g，薄荷3g，生姜6g，炙甘草3g等组成(由西安交通大学医学院第二附属医院中医科制剂室制成逍遥散稀释液)。甲状腺素片由山东省莱阳生物化学制药厂生产，规格：40g/L，批号：0401002；5HT放射免疫试剂盒、NE放射免疫试剂盒均由上海朗卡生物科技有限公司提供；0.04mmol/L戊巴比妥钠、0.15mmol/L氯化钠溶液均由西安交通大学医学院生理实验室提供。

　　1.3 动物模型的建立与分组给药 全部大鼠给予自由摄食及饮水，适应性饲养1周，并测出每只大鼠平均每日饮食量约为20g，饮水量约为0.02L。1周后将其随机分为空白对照组、肝郁模型组及逍遥散组，每组10只。空白对照组每天给予0.15mmol/L氯化钠溶液0.002L灌胃及充足饮食饮水。肝郁模型组及逍遥散组第1～4周给予甲状腺素片12.9mg/(kg·d)灌胃，自第5周开始，两组大鼠每日限定饮食饮水3次，每笼每次给以饲料50g，饮水0.05L，持续足够刺激时间及足够强度，共4周；至第5周时逍遥散组给以逍遥散稀释液6.15g/(kg·d)灌胃，共4周。

　　1.4 行为学指标的观察 实验期间观察大鼠的毛发、形体、爪甲、活动次数、饮水量、饮食量、二便颜色等外观行为方面的变化。

　　1.5 体温的测定 分别于造模第1天、第28天测定各组大鼠肛温。

　　1.6 血浆5HT、NE及E含量的测定 分别于造模的第28天、第44天、第56天用0.04mmol/L戊巴比妥钠40mg/kg麻醉动物后尾静脉采血，分离血浆，采用夹心ELISA法检测各组大鼠血浆中的5HT、NE及E的含量，具体操作按照试剂盒说明进行。

　　1.7 统计学处理 所有资料均以(±s)表示，运用SPSS11.5软件进行统计分析，组间差异采用单因素方差分析(OneWay ANOVA、LSD)，组内差异采用配对t检验(PairedSamples tTest)。

2 结　　果

　　2.1 不同造模时间各组大鼠外观行为的变化 至造模第28天时，肝郁模型组及逍遥散组大鼠均出现毛发变暗、枯黄，活动增多，易激惹，出汗较多，烦躁不安易怒，舌质鲜红等典型类似人类心肝火旺之症；至造模第44天时，肝郁模型组大鼠出现争斗，眼睛眯小，有眼屎，胡须下垂，饮食减少；逍遥散组大鼠活动略减少。至造模第56天时，肝郁模型组又出现背毛稀疏且枯黄无泽，爪甲紫暗，尾巴棕红且有鳞片，倦怠食少，形体瘦小，活动减少，叫声变细，反应迟钝，扎堆甚至倦卧，贴边。小便增多，大便由正常转为稀溏，舌质暗红等肝郁证的表现。而逍遥散组较上述症状轻，反应较敏捷，饮食饮水较正常。空白对照组大鼠于造模期间生长状况良好。

　　2.2 各组大鼠肛温的变化 第1天各组大鼠肛温均在正常范围(36.4～37.2℃)，且无显著性差异(P>0.05)；第28天肝郁模型组和逍遥散组肛温明显升高，与空白对照组相比有显著性差异(P<0.05，图1)。

　　2.3 各组大鼠血浆5HT水平的变化 肝郁模型组和逍遥散组与空白对照组比较，均有显著性差异(P<0.05)；第44天逍遥散组大鼠血浆5HT水平低于肝郁模型组(P>0.05)，至第56天有显著性差异(P<0.01)，与空白对照组相比，无统计学意义(P>0.05，表1)。

　　2.4 各组大鼠血浆E、NE水平的变化 肝郁模型组和逍遥散组与空白对照组比较大鼠血浆E、NE有显著性差异(P<0.01和P<0.05)；逍遥散组E、NE水平均低于肝郁模型组(P<0.01或P<0.05)；且第56天与第28天比较NE、E水平降低(P<0.01和P<0.05，表2)。表1 各组大鼠血浆5HT水平的变化表2 各组大鼠血浆E、NE水平的变化

3 讨　　论

　　肝郁证作为中医脏腑证候中常见的证候之一，在病症中有上升趋势[8]。其临床多以患者的主观感觉反映出来，确切的客观指标尚在探索之中，以往建立的肝郁模型表现不尽相同，目前仍无统一的评价标准[4]。现代医学研究认为[9]：西医学的心理应激理论与中医学情志致病相一致。当体处于应激状态时，就会出现以交感神经兴奋和下丘脑垂体肾上腺皮质(hypothalamuspituitaryadrenal， HPA)轴激活为主的一系列神经内分泌反应，从而引起神经递质5HT、E及NE的变化[10]。神经内分泌学已证实[11]，中枢内NE与5HT是调节情绪及行为的重要活性物质，NE增多出现易激惹、易发怒；5HT升高则呈现情绪低落状态。已有的相关研究发现[12]肝郁患者血浆中E、NE的含量发生改变，实证时血浆NE、E含量均增高且多伴有交感偏亢；由肝气郁结证形成肝郁脾虚证时血浆NE、E含量减低。毛海燕等[13]研究发现，肝郁证动物模型各脑区的5HT含量明显升高。本研究在中医脏腑七情内伤致病的理论指导下，利用甲状腺素调动神经体液信号系统兴奋性与机体交感神经直接相关的特点和中医理论中心肝火旺、郁怒伤肝的病症的临床模式存在某种内在规律的一致性[14]，促使在形成心肝火旺基础上运用饥饱失常法导致大鼠情志失常，肝气郁结，建立大鼠肝郁模型。并选取了血浆中E、NE、5HT的含量变化作为检测指标，结果显示肝郁模型组大鼠血浆中三者水平较空白对照组升高(P<0.01或P<0.05)。说明应用此方法可初步建立肝郁模型。

　　“木郁达之”是治疗肝郁证的总原则，逍遥散则是中医药治疗肝郁证的精典方，具有疏肝解郁、养血健脾的功效，方中柴胡疏肝解郁；当归、白芍养血柔肝；白术、茯苓健脾除湿；炙甘草益气补中，缓肝之急；薄荷助柴胡散肝郁，并清散肝郁所生之热；煨姜能温胃和中。现代医学认为逍遥散具有保肝、抗焦虑、抗抑郁、镇静、调节内分泌和平衡激素水平等多种作用[15]。并有大量研究发现[1617]逍遥散可能通过调节中枢5HT、NE等单胺类神经递质改善临床症状。本研究结果表明逍遥散可以明显改善肝郁模型组大鼠的症状、体征；降低肝郁大鼠血浆中5HT、NE、和E的含量(P<0.01或P<0.05)。这又从另一个方面验证了应用甲状腺素片及饥饱失常法可较好的建立肝郁证大鼠模型。

　　应用甲状腺素片及饥饱失常法建立的肝郁证大鼠模型，克服了因药物造模法引起的实质性肝损害和情志造模法某种程度上造成的大鼠机体直接损伤的缺点，更接近于肝郁证临床的病因和病症，较好的再现了中医情志致病的临床症状变化特点，为中医药研究治疗肝郁证提供了一种全新的造模方法。

参考文献

[1]任路， 李浩. 关于肝郁证动物模型研究现状及存在问题的思考 [J]. 中医药学报， 2006， 34(4):4447.

[2]吴相春，吴以岭. 气郁证动物模型研究进展 [J]. 时珍国医国药， 2008， 19(1):2325.

[3]柳润辉，陈忠梁，李铁军，等. 胆宁片对实验性急慢性肝损伤的保护作用 [J]. 药学实践杂志， 2007， 25(3):147149.

[4]徐建阳. 中医肝郁证的动物模型研究 [J]. 广州中医药大学学报， 2004， 21(1):7376.

[5]毛海燕. 肝郁证大鼠肝线粒体膜流动性血浆胃动素及血清胃泌素的变化及意义 [J]. 福建中医药， 2003， 34(3):4243.

[6]金光亮，南睿，郭霞珍. 慢性应激肝郁证大鼠模型的建立 [J]. 北京中医药大学学报， 2003， 26(2):1821.

[7]徐珊，王常松，周嘉鹤，等. 慢性萎缩性胃炎不同中医证型模型大鼠胃黏膜细胞增殖基因表达 [J]. 中国中西医结合杂志， 2007， 27(11):10041006.

[8]滕晶，王玉来，刘子旺. 肝气郁结证的研究总结与未来发展探讨 [J]. 中医药学刊， 2006， 24(12):2324.

[9]严灿，徐志伟. 肝主疏泄调畅情志功能的中枢神经生物学机制探讨 [J]. 中国中西医结合杂志， 2005， 25(5):459462.

[10]韦云，谭圣娥. 从中医脏腑看心理应激 [J]. 中医中药， 2008， 5(3):232233.

[11]BAO L， YAO XS， ZHAO L， et al. Correlation between changes of central neurotransmitter expression and stress response in mice: A restraint timecourse analysis [J]. Neural Regeneration Res， 2008， 3(2):167171.

[12]MURPHY DL， LEMER A， RUDNICK G， et al. Serotonin transporter: Gene， genetic disorders， and pharmacogenetics [J]. Mol Interv， 2004， 4(2):109123.

[13]毛海燕，叶林，叶向荣. 肝郁证大鼠中枢神经递质变化的观察 [J]. 福建中医药， 2002， 33(2):1718.

[14]雷长国，何仙童，宋兴. 肝郁证实质研究进展 [J]. 湖南中医， 2006， 22(5):8889.

[15]王晓强，高权国. 逍遥散的药理研究进展 [J]. 中医药信息， 2007， 24(1):4042.

[16]熊静悦，曾南，张崇燕. 逍遥散对CUMS模型大鼠行为学及脑内单胺类神经递质的影响[J]. 现代生物医学进展， 2007， 7(11):16351639.

[17]张虹，王明. 逍遥散对肝郁证大鼠脑内神经递质的影响 [J]. 中医药学刊， 2006， 24(7):13311332.