脑源性神经营养因子融合蛋白真核表达质粒的构建及表达

　　　　作者：石秦东，张蓬勃，田玉梅，张军峰，陈新林，刘勇

【摘要】 目的 构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的脑源性神经营养因子(BDNF)融合蛋白真核表达质粒，并对其表达和定位进行研究。方法 以人血白细胞DNA为模板，利用一对删除终止密码子的引物进行PCR获得BDNF基因片段，并将其与pEGFPN1质粒载体连接，构建BDNFEGFP融合蛋白真核表达质粒。以脂质体Lipofectamine2000 转染Hela细胞，提取总RNA，通过RTPCR方法检测BDNFEGFP在转录水平的表达，Western blot 及荧光显微镜进一步观察融合蛋白的表达定位。结果 酶切和PCR鉴定证实BDNF基因片段正确克隆入载体质粒中，转染Hela细胞后，RTPCR证实BDNFEGFP融合蛋白在转录水平有表达，荧光显微镜观察显示BDNFEGFP融合蛋白主要分布于细胞质中，Western blot结果显示Hela细胞培养液中有BDNFEGFP融合蛋白存在。 结论 成功构建了BDNFEGFP融合蛋白真核细胞表达质粒，BDNFEGFP融合蛋白能够在Hela细胞中表达，主要位于细胞质中并可以分泌到细胞外。

【关键词】 脑源性神经营养因子；绿色荧光蛋白；融合蛋白；Hela细胞

　　ABSTRACT: Objective To construct the eukaryotic expression vector of brainderived neutrophic factor (BDNFEGFP) fusion protein and to investigate its expression and location. Methods BDNF DNA was amplified from the genomic DNA isolated from the human leucocytes by PCR with a pair of primers without stop codon， and then subcloned into plasmid pEGFPN1. The recombinant plasmid was transfected into Hela cells with lipofectamine 2000. Total RNA was isolated， and then expression of BDNFEGFP gene was detected by RTPCR. The expression and cellular location of BDNFEGFP protein were examined by Western blot and fluorescence microscopy. Results By analyzing restriction enzyme digestion and PCR， we found that BDNF gene was correctly inserted into the plasmid vector. RTPCR results confirmed the expression of BDNFEGFP gene. The fluorescence microscopy indicated that the BDNFEGFP fusion protein was mainly distributed in cytoplasm. Western blot results showed that BDNFEGFP fusion protein existed in the medium of Hela cells. Conclusion We have successfully constructed the eukaryotic expression vector of BDNFEGFP fusion protein， which could be expressed in Hela cells. BDNFEGFP fusion protein is mainly located in cytoplasm and could be secreted into the outside.

　　KEY WORDS: brainderived neurotrophic factor; green fluorescence protein; fusion protein; Hela cells

　　 脑源性神经营养因子(brainderived neurotrophic factor， BDNF)是神经营养因子(neurotrophin family)家族成员之一，与其受体trkB 酪氨酸激酶广泛分布于脑组织，包括皮层、纹状体、海马、丘脑、小脑等[1]。BDNF除参与神经系统发育过程中神经元的存活、生长和分化外，越来越多的证据表明也参与了成年神经系统神经元的修复与重塑，诱导成年脑内源性神经前体细胞迁移至纹状体等部位[23]。因此，BDNF对神经损伤性疾病如脑血管病、脑外伤及神经退行性疾病如Alzheimer病的治疗具有潜在的应用前景。为进一步探索BDNF对内源性神经干细胞增殖分化的影响，我们通过基因重组技术构建了BDNF与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合蛋白真核表达质粒，并对其在真核细胞的表达及是否具有分泌功能进行了鉴定。

1 材料与方法

　　1.1 材料 质粒载体pEGFPN1(BD Biosciences Clontech公司)，PMD18T载体(TaKaRa公司)，限制性内切酶、T4DNA连接酶、胶回收试剂盒(TaKaRa公司)，Taq DNA聚合酶(Promega公司)，1640培养基(Invitrogen 公司)，Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen 公司)，Top10大肠杆菌、Hela细胞株(本实验室保存)，抗人BDNF抗体(Santa Cruz公司)。常用试剂为本室配制。

　　1.2 方法

　　1.2.1 人BDNF的克隆 采用酚/氯仿/异丙醇提取法提取人血白细胞DNA为BDNF基因克隆的模板，根据GenBank公布的人BDNF序列(M61186)设计BDNF上下游引物，扩增BDNF全长序列，在上下游引物前分别插入KpnⅠ和BamHⅠ酶切位点，引物由上海华诺公司合成：P1：5′CGGGTACCATGACCATCCTTTTCCTT3′，P2：5′GCGGATCCACTCTTCCCCTTTTAATG3′。PCR在50μL的总体积中进行，反应条件为94℃变性4min后开始循环，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min 30s，共30个循环后，再于72℃延伸10min，用DNA纯化试剂盒从10g/L琼脂糖凝胶回收、纯化所需PCR产物BDNF，用 T4连接酶将其亚克隆入T载体，酶切、PCR鉴定，由上海华诺公司测序。

　　1.2.2 pBDNFEGFPN1质粒的构建 测序正确后以KpnⅠ和BamHⅠ分别酶切pEGFPN1和克隆入目的基因的T载体，琼脂糖凝胶电泳以胶回收试剂盒分别回收4.7kb的pEGFPN1质粒骨架和大约760bp的BDNF片段，以T4连接酶4℃连接过夜，连接产物转化Top10感受态，37℃培养箱过夜培养，挑克隆过夜培养后提取质粒酶切、PCR鉴定。

　　1.2.3 细胞培养及质粒转染 将Hela细胞在含100mL/L FBS的RPM1640培养液(加入青霉素100u/mL，链霉素100u/mL)中，置37℃，50mL/L CO2条件培养箱中培养，每3d传代1次。转染前将Hela细胞以0.5×105/孔接种于24孔板，待细胞融合至50%左右时，采用脂质体Lipofectamine 2000转染质粒pBDNFEGFPN1和pEGFPN1，转染前后以无血清培养基培养3～6h。转染后3h更换完全培养基继续培养48h。

　　1.2.4 RTPCR检测BDNF转录水平的表达 分别收集质粒pBDNFEGFPN1和pEGFPN1转染的Hela 细胞，按Trizol试剂说明书抽提细胞总RNA，取1μg进行反转录。反转录20μL体系中加入总RNA 2μL，随机引物1μL，5×RT缓冲液4μL，dNTP(10mmol/L)2μL，RNAase抑制剂(10u/μL)1μL，MMLV逆转录酶1μL，h3O补足至20μL，混匀，30℃ 10min，42℃ 20min，99℃ 5min终止反应。以cDNA为模板进行PCR反应，反应条件同上，取等体积RTPCR产物进行10g/L琼脂糖凝胶电泳并照像。

　　1.2.5 荧光显微镜观察BDNF融合蛋白的表达 将转染质粒pBDNFEGFPN1和pEGFPN1的Hela细胞爬片以40g/L多聚甲醛固定20min，PBS洗片2次，37℃孵箱中干燥，以甘油封片，在荧光显微镜下观察融合蛋白的表达，激发波长为488nm。

　　1.2.6 Western blot 检测BDNF蛋白水平的表达 收集转染后细胞培养48h的培养液，经加热蛋白变性后进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)，然后以湿转法将蛋白质转移至硝酸纤维素膜(NC膜)，100g/L脱脂奶粉室温摇床封闭4h，加1∶500稀释的一抗antiBDNF，4℃孵育过夜，洗涤，辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗，室温孵育1h，加强化学发光(ECL)试剂于暗室自显影，X线片曝光。

2 结　　果

　　2.1 BDNF目的基因片段的扩增及序列分析 PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，可见大约760bp的特异性条带，回收纯化该核酸条带亚克隆于PMD18T载体，PCR、酶切证实目的基因插入T载体(图1)，测序证实所获得人BDNF的DNA序列与GenBank 公布的人BDNF序列(M61186)完全一致。

　　2.2 重组BDNF融合蛋白表达质粒的鉴定 测序正确的BDNF序列克隆入真核表达质粒pEGFPN1，经KpnⅠ和BamHⅠ酶切鉴定后得到760bp大小的片段，以BDNF上下游引物PCR扩增鉴定也得到760bp大小的片段。以BDNF上游引物和EGFP下游引物PCR扩增鉴定得到1.5kb大小的片段(图2)，说明BDNFEGFP融合蛋白真核表达质粒构建成功。

　　2.3 转染融合蛋白质粒Hela细胞中BDNF mRNA表达结果 转染pBDNFEGFPN1的细胞所提RNA能扩增出代表BDNF基因的760bp条带和内参βactin的450bp条带，而转染pEGFPN1的Hela 细胞所提RNA 仅能扩增出内参βactin的450bp条带(图3)，由于Hela细胞不表达BDNF基因[2]，本结果说明BDNF基因在转染pBDNFEGFPN1的Hela细胞中mRNA水平得到了表达。

　　图3 转染pBDNFEGFPN1或pEGFPN1的Hela细胞BDNF表达的RTPCR分析结果

　　Fig.3 RTPCR analysis of expression of BDNF in Hela cells transfected with plasmid pBDNFEGFPN1 or pEGFPN1. The cDNA fragments were amplified using BDNF primers (lanes B， C) or βactin primers (lane D， E)

　　2.4 转染融合蛋白质粒Hela细胞中BDNF蛋白的表达结果 Western blot结果显示，转染pBDNFEGFPN1质粒的Hela细胞培养液中可以检测到60ku大小BDNFEGFP融合蛋白的表达，而转染pEGFPN1质粒的Hela细胞培养液中则不能检测到BDNF融合蛋白的表达(图4)，说明BDNF融合蛋白在转染的Hela细胞中蛋白水平上得到了表达并且可以分泌到细胞外。

　　2.5 融合蛋白绿色荧光蛋白表达结果 荧光显微镜观察结果显示，在转染pBDNFEGFPN1质粒的Hela细胞中，绿色荧光主要分布于胞质，而转染pEGFPN1质粒的Hela细胞中，绿色荧光分布于胞质和胞核(图5)，提示融合蛋白在转染细胞中表达具有定位特性。

3 讨　　论

　　BDNF是具有多种生物效应的细胞因子，在多种神经元细胞包括多巴胺能、感觉、小脑、运动等神经元的生存及分化中起重要作用[45]。人BDNF基因位于11号染色体，全基因长744bp，为单一外显子，其合成30ku大小的前体蛋白[6]，经水解加工后可形成含有119个氨基酸残基、分子质量为13ku的成熟肽。BDNF与其高亲和力受体酪氨酸激酶受体TrkB结合，引起受体磷酸化，细胞内酪氨酸激酶区域活化，介导复杂的细胞内信号传导通路发挥生物学功效[1，7]。近年来的研究表明，BDNF促进成年脑内神经干细胞的增殖、分化[8]，成年脑内的神经再生(neurogenesis)对神经系统疾病如脑卒中、Parkinson病、Alzheimer病的治疗具有重要意义[9]。为进一步研究BDNF的生物学效应，我们构建了具有示踪作用的BDNFEGFP融合蛋白真核细胞表达载体，并对其在无BDNF分泌的Hela细胞中的表达和分泌进行了研究。

　　EGFP在紫外或蓝光激发下发出绿色荧光，且荧光性质稳定，对细胞无毒性，可行活细胞检测[10]。因此，本研究选用EGFP为报告基因，采用基因工程技术构建了EGFPBDNF融合蛋白真核表达载体，经酶切测序鉴定证明载体构建成功。进一步转染无BDNF表达的真核细胞Hela细胞，结果显示融合蛋白BDNFEGFP在转染Hela细胞后主要分布于细胞质中，核内基本上无分布；而EGFP广泛分布于细胞核和细胞质中，且明显集中于细胞核，与融合蛋白的表达不同。结合Western blot实验结果，在细胞培养液中可以检测到BDNFEGFP融合蛋白的存在，说明BDNFEGFP融合蛋白可以穿过细胞膜分泌到细胞外。荧光显微下观察结果显示BDNFEGFP融合蛋白在Hela细胞的荧光强度较EGFP弱，也可能与部分融合蛋白分泌到细胞外有关。

　　本研究结果提示构建的BDNFEGFP融合蛋白真核表达质粒可以在真核细胞表达，其表达产物BDNFEGFP融合蛋白可以分泌到细胞外，在细胞质内外均存在，具有穿膜特性，为以后进一步研究其能否与靶细胞膜上的TrkB受体结合发挥生物学效应奠定了基础。

参考文献

[1]TAPIAARANCIBIA L， RAGE F， GIVALOIS L， et al. Physiology of BDNF: focus on hypothalamic function [J]. Front Neuroendocrinol， 2004， 25(2):77107.

[2]BENRAISS A， CHMIELNICKI E， LERNER K， et al. Adenoviral brainderived neurotrophic factor induces both neostriatal and olfactory neuronal recruitment from endogenous progenitor cells in the adult forebrain [J]. J Neurosci， 2001， 21(17):67186731.

[3]HENRY RA， HUGHES SM， CONNOR B. AAVmediated delivery of BDNF auguments neurogenesis in the normal and quinolinic acidlesioned adult rat brain [J]. Eur J Neurosci， 2007， 25(12):35133525.

[4]KALB R. The protean actions of neurotrophins and their receptors on the life and death of neurons [J]. Trends Neurosci， 2005， 28(1):511.

[5]MAKAR TK， TRISLER D， EGLITIS MA， et al. Brainderived neurotrophic factor (BDNF) gene delivery into the CNS using bone marrow cells vehicles in mice [J]. Neurosci Lett， 2004， 356(3):215219.

[6]MOWLA SJ， FARHADI HF， PAREEK S， et al. Biosynthesis and posttranslational processing of the precursor to brainderived neurotrophic factor [J]. J Biol Chem， 2001， 276(16):1266012666.

[7]KLEIN R， CONWAY D， PARADA LF， et al. The trkB tyrosine protein kinase gene codes for a second neurogenic receptor that lacks the catalytic kinase domain [J]. Cell， 1990， 61(4):647656.

[8]CHMIELNICKI E， BENRAISS A， ECONOMIDES AN， et al. Adenovirally expressed noggin and brainderived neurotrophic factor cooperate to induce new medium spiny neurons from resident progenitor cells in the adult striatal ventricular zone [J]. J Neurosci， 2004， 24(9):21332142.

[9]胡海涛，董炜疆. 阿尔茨海默病防治研究的现状与展望 [J]. 西安交通大学学报(医学版)， 2007， 28(1):15.

[10]WIEDENMANN J， NIENHAUS GU. Livecell imaging with EosFP and other photoactivatable marker proteins of the GFP family [J]. Expert Rev Proteomics， 2006， 3(3):361374