氯化两面针碱诱导人肝癌细胞SMMC7721凋亡的研究

　　　　作者：李丹妮，刘华钢，刘丽敏，刘林，梁霜

【摘要】 目的 研究氯化两面针碱诱导人肝癌细胞SMMC7721凋亡的作用。方法 采用噻唑蓝(MTT)比色法检测人肝癌细胞SMMC7721生长活力；Hoechst33258核染色，观察细胞形态学变化；流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率。结果 氯化两面针碱作用于细胞后，在体外呈浓度、时间依赖性显著抑制SMMC7721细胞的生长，作用24、48、72h的半数抑制浓度(IC50)分别为(19.5±1.8)、(3.8±0.2)、(2.8±0.1)mg/L；Hoechst33258染色后，可见核染色质凝集，凋亡细胞呈致密浓染，与对照组相比，氯化两面针碱处理后凋亡细胞比例增加；流式细胞仪检测到G2/M细胞比例增加，G0/G1、S期细胞比例下降。药物作用于SMMC7721细胞后，随浓度增加细胞凋亡率增加。结论 氯化两面针碱对SMMC7721细胞有明显的生长抑制作用，可能与改变细胞周期并诱导细胞凋亡有关。

【关键词】 氯化两面针碱；SMMC7721细胞；G2/M期阻滞；细胞凋亡；肝癌

　　ABSTRACT: Objective To study the effect of nitidine chloride in inducing apoptosis of human hepatoma cell SMMC772l. Methods Cell viability was measured by MTT assay in human hepatoma cell line SMMC7721. Morphological changes of cell nuclei were observed by Hoechst 33258 staining. Flow cytometry was performed to measure the cell cycle and cell apoptosis. Results Proliferation of SMMC7721 cells was significantly inhibited by nitidine chloride in concentration and time dependent manners in vitro， the 50% inhibition concentration (IC50) value at 24， 48， and 72h being (19.5±1.8)， (3.8±0.2) and (2.8±0.1)mg/L， respectively. The chromatine concentration and apoptotic cells with high concentrations were observed by Hoechst 33258 staining. The percentage of apoptotic cells increased in nitidine chloride treated groups compared with that in the control group. The percentage of cells in G2/M phase increased and that of G0/G1， S phases was decreased according to flow cytometry determination. After treatment with nitidine chloride， apoptosis rate of SMMC7721 cells increased with the increase of concentration. Conclusion Nitidine chloride significantly inhibits the growth of SMMC7721 cells. The antihepatoma mechanism of SMMC7721 cells may be associated with the changes of cell cycle and inducing cell apoptosis.

　　KEY WORDS: nitidine chloride; SMMC7721 cell; G2/M phase arrest; cell apoptosis; hepatome

　　肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，恶性程度高，目前尚缺乏有效的治疗药物。细胞凋亡比例明显失调是肿瘤发生发展中的重要因素，如能诱导肿瘤细胞凋亡，使其凋亡的比例增加，则可能遏制肿瘤的发生发展。

　　氯化两面针碱(nitidine chloride)属于苯菲啶型生物碱，为黄治勋等[1]从芸香科花椒属植物两面针的干燥根提取的一种生物碱。已有的研究主要是抗炎、镇痛、解痉等，关于抗肿瘤作用机制也有相关报道，如氯化两面针碱对慢性细胞型白血病有较好的临床疗效[1]。而对肝癌的治疗还在实验研究阶段，目前国内外报道很少。本实验以肝癌细胞SMMC7721为对象，研究氯化两面针碱对肝癌细胞的生长抑制及其诱导细胞凋亡的作用，探讨其治疗肝癌的可能性。

1 材料与方法

　　1.1 材料与仪器 氯化两面针碱购自中国药品生物制品检定所(批号：110848200502，纯度>98%)；胰蛋白酶、噻唑蓝(MTT)购于AMRESCO公司；RPMI1640培养基购于美国GIBCO公司；新生牛血清购自杭州四季青生物工程公司；Hoechst33258购自江苏省碧云天生物技术研究所；Annexin VFITC细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；核糖核酸酶A(RNaseA)为MBI公司产品；碘化丙啶(propidium iodide， PI)为Sigma公司产品。EpicsXL Ⅱ型流式细胞仪为美国Beckman Coulter公司产品，使用Muticycle AV分析软件。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 置37℃、50mL/L CO2的培养箱中，用含100mL/L新生牛血清以及青链霉素各100u/mL的RPMI 1640培养液培养，倒置显微镜观察细胞生长情况，2.5g/L胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

　　1.2.2 MTT法检测细胞的存活率 将氯化两面针碱用DMSO助溶，用基础培养基依次对半稀释成五个梯度的母液，调整各浓度中DMSO助溶剂质量浓度相同。取对数生长期细胞，以每孔0.19mL(约0.3×104个/孔)接种于96孔板，培养24h待细胞贴壁后，分别加入不同质量浓度的氯化两面针碱10μL，使其终浓度分别为0.8、1.6、3.2、6.4、12.8mg/L，对照组加含等浓度DMSO的基础培养基。每个剂量组设4个复孔，其中DMSO终浓度为2.5g/L，将各组细胞继续培养24、48、72h。在规定时间，每孔加入10μL MTT(5g/L)，继续培养4h后倾去培养液，加入DMSO 0.15mL/孔，平板震荡器振荡5min，充分溶解蓝紫色颗粒，空白孔调零，用酶标仪以570nm/630nm双波长测定各组细胞吸光度(A)值，细胞增殖抑制率=(1-实验组平均A值/对照组平均A值)×100%。重复上述实验3次，Bliss法计算半数抑制浓度(IC50)值。根据IC50值设定后继实验的作用浓度。

　　1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期 收集0、2、4、8mg/L氯化两面针碱处理24h的细胞，PBS冲洗2次，用700mL/L乙醇4℃固定过夜，PBS洗涤离心去上清，加入适量含100mg/L RNaseA和50mg/L PI的染液，调整细胞浓度到1×105个/mL左右，4℃避光染色30min，流式细胞仪检测。激发波长为488nm，用MultiCycle AV软件进行细胞周期分析，以计算各期细胞百分率。

　　1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 收集0、2、4、8mg/L氯化两面针碱处理24h的细胞，用胰酶消化收集，PBS洗涤2次(1000r/min离心5min)收集(1～5)×105细胞；加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞；加入5μL Annexin VFITC混匀后，加入5μL PI，混匀；室温避光反应5～15min；在1h内，流式细胞仪观察和检测。

　　1.2.5 细胞凋亡的形态学观察 取普通洁净盖玻片于700mL/L乙醇中浸泡过夜，PBS溶液洗涤3次，再用细胞培养液洗涤1次。将盖玻片置于6孔板内，收集0、2、4、8mg/L氯化两面针碱处理24h的细胞培养过夜，待细胞长满孔内盖玻片50%～80%之后，吸尽培养液，加入0.5mL固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)固定10min，去固定液，用PBS洗2×3min，吸尽液体。加入0.5mL Hoechst 33258染色液，染色5min。洗涤及染色应用摇床或手动晃动数次。用PBS洗2×3min。倒置荧光显微镜可观察到呈蓝色荧光的细胞核，并摄影拍照。

　　1.2.6 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件处理，数据用±s表示，进行重复测量的方差分析，P<0.01为差异有统计学意义。

2 结　　果

　　2.1 MTT法的测定结果 随着氯化两面针碱浓度增加，细胞抑制率升高，3.2～12.8mg/L组作用24、48、72h后，明显抑制肿瘤细胞生长，呈浓度、时间依赖关系(表1、图1)。采用Bliss法求得24、48、72h IC50值分别为(19.5±1.8)、(3.8±0.2)、(2.8±0.1)mg/L。表1 氯化两面针碱对SMMC7721细胞增殖的抑制作用

　　2.2 细胞凋亡的形态学改变 Hoechst染色，产生蓝色荧光为凋亡细胞。氯化两面针碱0、2、4、8mg/L处理24h后，随着药物浓度增加，蓝色荧光亮度、强度都比对照组增强；呈现蓝色荧光的凋亡细胞数也比对照组显著增多，具有一定的浓度依赖性(图2)。

　　2.3 流式细胞仪检测氯化两面针碱诱导肝癌细胞凋亡的结果 0、2、4、8mg/L的氯化两面针碱处理24h后，可明显提高G2/M期的细胞比例，使S、G0/G1期的细胞比例减少(图3)。而经2、4、8mg/L氯化两面针碱处理后，细胞凋亡率分别为18.9%、23.3%、28.3%，显著高于对照组(2.00%)，具有统计学意义(P<0.01)，凋亡率随浓度增大而增高，呈现浓度依赖性(图4)。

　　3 讨　　论

　　在我国传统医药开发应用中，两面针具有较悠久的药用历史。近年来，广西、广东、上海等地以两面针为主药，不断研究开发两面针新药。本实验结果显示，氯化两面针碱对SMMC7721细胞的增殖具有显著抑制作用，呈明显的时间、浓度相关性。其中1.6mg/L组在作用SMMC7721细胞24h后出现抑制作用；3.2mg/L组在48h后抑制率达40.6%，随着作用时间延长和浓度增加，抑制作用增强。3.2～6.4mg/L组作用48h后达到半数抑制率。根据抗肿瘤药物疗效的评价标准之一[2]，即体外抑瘤实验：合成化合物或植物提取物纯品的IC50<10mg/L或植物粗提物的IC50<20mg/L，并有细胞毒性的剂量依赖关系，且最高抑制效率应达80%以上，则判定样品在体外对细胞有杀伤作用。本实验采用Bliss法求得氯化两面针碱对SMMC7721癌株48h的IC50为(3.8±0.2)mg/L，均小于10mg/L，且72h最高抑制效率超过80%，故由此可判断氯化两面针碱体外对SMMC7721癌株有杀伤作用。

　　本实验应用流式细胞技术探讨氯化两面针碱抑制人肝癌细胞SMMC7721作用机制。不同浓度组作用SMMC7721细胞24h后，细胞周期中G2/M期细胞百分比明显增加，且呈量效关系，提示氯化两面针碱阻断SMMC7721细胞周期于G2/M期。许多学者[36]在胃淋巴瘤、食管鳞癌、喉鳞癌、舌鳞癌等肿瘤的研究中发现普遍存在G2/M期调控因子cdc2和cyclinB1表达的异常。王博龙等[7]研究发现氯化两面针碱作用前后细胞内cdc2和cyclinB1的mRNA水平及其蛋白表达的变化，在细胞呈现G2/M期阻滞时，cyclinB1基因转录下降，随着氯化两面针碱作用时间的延长，cyclinB1 mRNA水平进一步降低，而cdc2 mRNA水平未见明显变化;蛋白cyclinB1与cdc2表达变化与其mRNA水平一致。由此可见，氯化两面针碱有可能通过下调cyclinB1的转录与表达，降低成熟促进因子的形成来诱导KB细胞及其耐药株KBV200的G2/M期阻滞，从而抑制其增生，当然G2/M期阻滞也有细胞周期素依赖性激酶抑制子参与调节的可能，相关机制有待于进一步研究。AnnexinVFITC/PI双染法结果显示，氯化两面针碱具有诱导肝癌细胞凋亡的作用，并且具有浓度依赖性。因此，推测氯化两面针碱可通过改变细胞周期进一步诱导肝癌细胞SMMC7721发生凋亡。

　　本研究结果表明氯化两面针碱能够诱导SMMC7721细胞凋亡，对后续动物实验以及临床研究具有一定的指导意义。两面针普遍分布于广西，资源丰富，明确其活性成分氯化两面针碱的抗肝癌效应，不仅具有很大的开发应用价值，又能振兴地方药业，造福人类。

参考文献

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