海洛因暴露对子代小鼠海马凋亡相关基因表达的影响

　　　　 作者：王莹，杜克莘，李明，施京红，谢雯

【摘要】 目的 观察子宫内海洛因暴露对小鼠海马caspase3、Bcl2和Bax表达的影响，探讨线粒体凋亡通路在海洛因暴露引起子代小鼠神经、行为发育异常中的作用。方法 于小鼠胚龄(embryonic day)E9～E18d时，每天给孕鼠皮下注射海洛因10mg/kg，建立子宫内海洛因暴露的小鼠模型。按出生前处理将仔鼠分为空白组(Con)、盐水组(Sal)和海洛因组(Her)。待仔鼠14d时取海马，应用RTPCR和Western Blot检测caspase3、Bcl2和Bax的表达情况。结果 与Con和Sal组相比，Her组仔鼠的caspase3和Bax的蛋白表达明显增加(P<0.05)，而Bcl2蛋白表达明显下降(P<0.05)。结论 海洛因暴露可引起子代小鼠海马caspase3和Bax表达上调，Bcl2表达下调，提示线粒体凋亡通路可能参与了海洛因损伤小鼠神经行为发育的分子机制。

【关键词】 海洛因；caspase3；Bcl2；Bax；海马；线粒体凋亡通路；神经行为缺陷；小鼠

　　ABSTRACT: Objective To investigate whether prenatal (P) apoptotic mechanism is involved in neurobehavioral defects in hippocampus caused by heroin exposure in uterus. Methods Animal model was established by administering heroin 10mg/(kg·d) subcutaneously to pregnant BALB/c mice on E9E18. The offspring were pided into 3 groups according to the maternal treatment: the control (Con)， saline (Sal) and heroin (Her) groups. Hippocampuses of pups were harvested on postnatal day (P) 14， and RTPCR and Western blot were applied to detect the expressions of caspase3， Bcl2 and Bax. Results Alterations in apoptosisregulating proteins were found， the expressions of caspase3 and Bax were increased and Bcl2 expression was decreased at mRNA and protein levpls (P<0.05)， indicating an increase in mitochondrial apoptotic pathways in mice prenatally exposed to heroin compared with the controls. Conclusion Heroin exposure may cause the uprogulation of caspase3 and Bax expressions and downregulation of Bcl2 expression of offspring mouse hippocampus. We hypothesize that the apoptotic changes may， at least in part， contribute to heroin teratogenicity during development and lead to hippocampusdependent neurobehavioral deficits.

　　KEY WORDS: heroin; caspase3; Bcl2; Bax; hippocampus; mitochondrial apoptotic pathway; neurobehavioral dificit; mice

　　据中国国家禁毒委员会报告，近年来女性毒品滥用者增多，约占全部吸毒者的20%～30%，且年龄集中在22～27岁之间，属于育龄期女性[1]。资料报道，海洛因(学名二乙酰吗啡)可迅速通过胎盘屏障和胚胎血脑屏障，直接作用于发育中的神经细胞。宫内海洛因暴露不但可引起新生儿宫内窘迫和发育迟缓，还可导致子代成年后长期的认知行为缺陷和社会行为障碍[2]，但其细胞、分子机制未完全阐明。

　　细胞凋亡是受基因精确调控的主动性死亡过程，该过程中特定基因编码的自杀性蛋白表达激活而最终导致DNA裂解，细胞死亡。研究发现，线粒体凋亡通路可被多种毒性制剂或致畸因子所激活[3]，诱导线粒体细胞色素C释放，活化caspases蛋白酶家族或诱导凋亡诱导因子释放，从而执行凋亡。线粒体介导的凋亡途径是否参与了海洛因对发育期神经系统的毒性作用，目前未见报道。本研究旨在探讨宫内海洛因暴露后小鼠特异脑区的凋亡情况。

1 材料与方法

　　1.1 药品与试剂 标准品海洛因(Heroin)，纯度98.5%，由中国药品生物制品检定所提供，批号171206200614；Trizol购自美国Invitrogen公司；反转录PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；兔抗鼠caspase3、Bcl2、Bax单克隆抗体购自美国Santa Crutz Biotechnology公司。

　　1.2 建模及分组 选健康活泼BALB/c小鼠60只，雌雄各半，2月龄，体重(25±5)g，由第四军医大学实验动物中心提供。动物自由饮食饮水，昼夜12h交替光照，室温25℃。每日21∶00雌雄合笼，次日晨查精栓或阴道涂片，以精栓或阴道涂片查到精子作为受精标志，记为E0。体重相近的实验动物随机分为空白组(Con)、生理盐水组(Sal)和海洛因组(Her)组。从E0～E8各组动物自由进食，E9～E18，每天于21∶00给予Sal组孕鼠大腿外侧皮下注射生理盐水20mL/kg，Her组孕鼠注射海洛因10mg/kg，药物溶于生理盐水中(0.5g/L)。子代分组同亲代孕鼠。

　　1.3 Caspase3、Bcl2和Bax基因表达的检测 待仔鼠14d龄时取材，0.16mol/L戊巴比妥钠腹腔麻醉，速断头、开颅、分离海马，即刻入液氮，冻存管分装，-80℃贮存。Trizol法提取组织细胞的总RNA。各取1μg RNA，逆转录合成cDNA。应用RTPCR法检测caspase3、Bcl2和Bax基因的表达情况。βactin为内参照。琼脂糖凝胶电泳后扫描DNA条带吸光度，以各基因与βactin的吸光度之比作为该基因的相对表达。所用引物序列、退火温度及产物片段见表1。表1 引物序列、退火温度及产物片段

　　Tab.1 Primer sequence， temperature and product size

　　mRNAForward primerReverse PrimerTm (℃)Product size (bp)βactin5′ATCATGTTTGAGACCTTCAACAC3′5′TCTGCGCAAGTTAGGTTTTGTC3′57825Caspase35′GGAGCTGGACTGTGGCATTGA3′5′CAGTTCTTTCGTGAGCATGGA3′60322Bcl25′GGTGCAGCGATTTCGTACC3′5′AAGAGGATGAGCAGTCAGAGG3′60206Bax5′TCCCACATAACTCCCTCGACA3′5′GGCGAAGCCAGCGAGAAGTCCC3′61228

　　1.4 Caspase3、Bcl2和Bax 蛋白表达的检测 海马组织取材同前。蛋白抽提后，BCA法进行蛋白质定量。制胶，每孔取50μg蛋白上样，加入6×上样缓冲液，煮沸5min，进行SDSPAGE，电泳完毕，湿转至硝酸纤维素滤膜，50g/L脱脂奶室温封闭2h后，加入(1∶1000)caspase3、(1∶600)Bcl2和(1∶800)Bax 兔单克隆抗体，室温孵育30min，4℃过夜，TBST洗涤3次，每次10min，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶3000)，室温孵育1h，TBST洗涤4次，每次15min，ECL显影。以βactin为内参照。采用GDS8000型凝胶成像分析系统测量各阳性条带的吸光度，将各组阳性条带与相应的βactin条带的吸光度比作为其蛋白的相对表达。

　　1.5 统计学处理 所有数据均采用SPSS13.0进行统计学处理，多样本均数比较采用单因素方差分析(One WayANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结　　果

　　2.1 海洛因暴露对caspase3、Bcl2和Bax mRNA表达的影响 图1纵轴表示各组目的条带mRNA的相对表达与Con组和Sal组mRNA相对表达的比值。较之Sal组和Con组，Her组中caspase3和Bax的mRNA表达显著增多，Bcl2 mRNA的表达显著减少(P<0.05，图1)。

　　2.2 海洛因暴露对caspase3、Bcl2和Bax蛋白表达的影响 图2纵轴表示各组目的条带蛋白的相对表达与Con组和Sal组蛋白相对表达的比值。与Sal组和Con组比较，Her组小鼠海马组织caspase3(17ku)、Bax蛋白表达明显增加，Bcl2蛋白表达明显降低(P<0.05，图2)。

　　3 讨　　论

　　本研究显示，发育期海洛因暴露可激活特异脑区的线粒体凋亡通路。

　　3.1 海洛因对凋亡调节因子Bcl2和Bax的影响 凋亡的调节非常复杂，参与的分子也非常之多。Bcl2是调节凋亡最重要的蛋白质家族，如Bcl2、BclxL、Bax、Bad等，分别发挥抗凋亡或促凋亡作用。Bcl2可定位于线粒体、内质网及核膜上，通过阻止线粒体细胞色素C的释放而发挥抗凋亡作用。Bax主要位于胞浆，凋亡发生时移至线粒体并与线粒体膜相结合。Bax促进凋亡，而Bcl2可抑制多种细胞毒因素引起的细胞死亡，Bcl2的过度表达可降低caspase 活性[4]。本研究发现，发育期海洛因暴露导致Bcl2表达上调和Bax表达下调，提示线粒体凋亡通路过度激活，细胞对死亡信号的反应增强，细胞死亡增多。

　　3.2 海洛因通过激活caspase3而增加细胞凋亡 凋亡的效应期由caspases级联反应构成。caspases是涉及蛋白溶解系统活化的一组半胱氨酸蛋白酶家族，多数和凋亡有关，被激活后发生凋亡蛋白酶的层叠级联放大反应，最终导致蛋白裂解，细胞消亡。Caspase3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，被誉为死亡蛋白酶，其上调表明凋亡通路被激活，细胞死亡增加。某些神经退行性疾病如Parkinson、Alzheimer病中均可见caspase3激活，而其中某些因凋亡引发的细胞缺失可用caspase抑制剂预防[5]。本研究中海马的caspase3过表达显示该脑区细胞凋亡增加，提示其相应的学习记忆功能可能受到影响。

　　3.3 发育期凋亡增加可影响海马的细胞构筑 海洛因对动物的神经、精神、免疫和生殖系统均证实有毒性作用[6]。本研究首次探讨了发育期海洛因暴露对凋亡的影响。细胞凋亡是脑发育中非常关键的生理机制，中枢神经系统至少50%～80%的神经元最终发生凋亡，发育期多次出现的凋亡高峰使细胞数量得以精确调整，以构建精准的神经回路[7]。发育期细胞凋亡的异常增多或减少，都会损伤组织器官的结构和功能。本研究认为，海洛因可能通过影响胚脑凋亡通路中关键基因的表达而导致海马的形态结构异常，进而参与形成这些脑区的功能障碍。

参考文献

[1]杨凤瑞，高伟，顾迎莉，等. 2006年中国禁毒报告 [R]. 国家禁毒委员会报告， 2007:25.

[2]YANAI J， BENSHAANAN TL， HAIMOVITCH H， et al. Mechanismbased approaches for the reversal of drug neurobehavioral teratogenicity [J]. Ann N Y Acad Sci， 2006， 1074:659671.

[3]MIRKES PE. To die or not to die， the role of apoptosis in normal and abnormal mammalian development [J]. Teratology， 2002， 65(5):228239.

[4]OTTER I， CONUS S， RAVN U， et al. The binding properties and biological activities of Bcl2 and Bax in cells exposed to apoptotic stimuli [J]. J Biol Chem， 1998， 273(11):61106120.

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