甘氨脱氧胆酸盐诱导人正常肝细胞 HL7702凋亡及其机制的研究

　　　　作者：传良敏，洪华，黄文芳，杨永长，饶绍琴，邓君

【摘要】 目的 观察甘氨脱氧胆酸盐(glycodeoxycholate， GCDC)对人正常肝细胞株HL7702凋亡的影响，并探讨其凋亡机制。方法 终浓度分别为100、150、200、250μmol/L的GCDC处理HL7702细胞24h，光学显微镜观察GCDC对HL7702细胞形态的影响，AnnexinVFITC/PI双染色法检测HL7702细胞的凋亡率 ，用荧光指示剂Fluo3/AM测定HL7702细胞内钙离子浓度，RTPCR测定Bcl2、Bax基因mRNA表达水平。结果 终浓度为150μmol/L的GCDC处理HL7702细胞24h后，细胞出现典型的凋亡细胞形态学改变；100、150、200、250μmol/L的GCDC均可诱导HL7702细胞凋亡，呈剂量依赖性，凋亡率分别为(13.16±2.9)% (t=6.41)、(20.3±3.0)% (t=10.22)、(25.02±2.1)% (t=18.11)、(45.02±3.5)% (t=28.89)，较对照组(2.2±0.6)%显著升高(P<0.05)；GCDC能使HL7702细胞内钙离子浓度增加，且具有浓度依赖性；GCDC使细胞内Bcl2 mRNA的表达下降、Bax mRNA的表达增加。结论 GCDC可能是通过增加HL7702细胞内钙离子浓度，并进一步下调Bcl2、上调Bax表达水平，从而诱导细胞凋亡。

【关键词】 甘氨脱氧胆酸盐；细胞凋亡；钙离子；Bcl2；Bax；肝细胞

　　ABSTRACT: Objective To investigate the apoptosis of cultured normal human hepatocyte HL7702 cells induced by glycodeoxycholate (GCDC) and to explore its possible mechanism. Methods HL7702 cells were incubated with various concentrations (100， 150， 200 and 250μmol/L) of GCDC. The changes of cellular morphology were observed under optical microscope. The apoptosis rate of HL7702 was determined by Annexin VFITC/PI double staining. The changes of HL7702 cell intracelluar [Ca2+]i were determined with Fluo3/AM load technique.The mRNA expression levels of Bcl2/Bax in HL7702 cells were analyzed by RTPCR. Results Typical apoptotic morphological changes were observed after HL7702 cells had been treated with 150μmol/L GCDC for 24h; HL7702 cells could be induced to undergo apoptosis in a concentrationdependent manner after 100， 150， 200， and 250μmol/L GCDC treatment for 24 hours. The apoptosis rates were (13.16±2.9)%， (20.3±3.0)%， (25.02±2.1)% and (45.02±3.5)%， which were markedly higher (P<0.05) than those of the control group. The intracellular [Ca2+]i was increased in a concentrationdependent manner when HL7702 cells were incubated with GCDC. The expression of Bcl2 mRNA was decreased and the expression of Bax mRNA was increased. Conclusion GCDC can induce HL7702 cells apoptosis. The potential mechanism of apoptosis might be related to increasing intracellular [Ca2+]i， downregulating the expression of Bcl2 mRNA and upregulating the expression of Bax mRNA.

　　KEY WORDS: glycodeoxycholate; cellular apoptosis; [Ca2+]i; Bcl2; Bax; hepatocyte

　　肝脏疾病是威胁人类生命的主要疾病之一。许多肝脏疾病可使胆汁的分泌或(和)排泄受阻导致胆汁淤积，而胆汁在细胞内的堆积是导致肝细胞损伤的主要原因之一。甘氨脱氧胆酸盐(glycodeoxycholate， GCDC)是体内的主要结合胆汁酸，研究证实它可诱导原代培养的大鼠肝细胞凋亡，细胞凋亡率与GCDC呈时间与剂量依赖性[1]。但是，GCDC能否诱导人正常肝细胞凋亡以及机制，尚未见相关报道。本实验观察GCDC对人正常肝细胞株HL7702细胞凋亡、细胞内钙离子浓度、Bcl2和Bax基因表达水平的影响，从而探讨其凋亡机制。

1 材料与方法

　　1.1 细胞株 人正常肝细胞株HL7702购自四川大学华西临床医学院基础与法医学免疫室。

　　1.2 实验试剂 RPMI 1640培养基购自美国GIBCO公司；小牛血清购自美国GM公司；甘氨脱氧胆酸盐(GCDC)购自Sigma公司；胰酶细胞消化液购自碧云天生物技术研究所；Annexin VFITC/pI检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；钙离子测定试剂盒购自美国Biotium公司；RNA提取试剂盒、RTPCR试剂盒、DNA marker、引物合成均由北京赛北盛基因技术有限公司提供。

　　1.3 细胞培养 将浓度为1×105个/mL的HL7702细胞接种于含100mL/L小牛血清、青霉素100u/mL、链霉素100u/mL的RPMI 1640培养基中，在37℃、饱和湿度、50mL/L CO2培养箱中常规培养24h后换液，处理组加入GCDC，使终浓度分别为100、150、200、250μmol/L，同时设立阴性对照组(不加GCDC)，培养24h，收集各GCDC处理组和阴性对照组细胞，用于以下实验。

　　1.4 细胞形态学的观察 收集150μmol/L GCDC处理组和阴性对照组细胞，离心涂片，瑞氏染色，光镜下观察细胞形态。

　　1.5 Annexin VFITC/PI检测细胞凋亡率 收集各GCDC处理组和阴性对照组细胞，用PBS洗涤细胞2次，500μL结合缓冲液重悬浮细胞，加入1μL Annexin VFITC混匀后再加入5μL碘化丙啶溶液，混匀后室温避光反应5min，流式细胞仪检测。早期凋亡细胞Annexin VFITC染色为主，在流式细胞分析图上为右下区细胞簇；晚期凋亡细胞则Annexin VFITC/PI双染色，在流式细胞分析图上为右上区细胞簇。

　　1.6 细胞内钙离子浓度的测定 收集各GCDC处理组和阴性对照组细胞，DHanks洗涤3次，离心去上清，收集(1～2)×106个细胞；加入1mL 10μmol/L荧光染料Fluo3/AM， 37℃、50mL/L CO2的培养箱中避光孵育1h；离心弃上清，DHanks洗涤3次，再加1mL DHanks液平衡10min，流式细胞仪检测(激发波长506nm，吸收波长526nm)，结果以10000个细胞平均荧光强度(mean fluorescence intensity， MFI)表示细胞内钙离子的相对含量。

　　1.7 RTPCR检测Bcl2、Bax mRNA的表达水平

　　按试剂盒说明提取总RNA，GAPDH、Bcl2、Bax的引物及扩增片断长度见表1。RTPCR按说明书进行，扩增条件：94℃ 5min；94℃ 30s，56℃ 45s，72℃ 90s，30个循环；最后72℃延伸5min。PCR产物用含0.5mg/L溴化乙锭的15g/L琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统Quantity one 软件分析结果，以目的基因与GAPDH条带的相对含量比值表示。 表1 PCR引物序列和产物长度

　　1.8 统计学处理 结果以均数±标准差(±s)表示，组间均数比较采用单因素方差分析，处理组与对照组比较采用最小有意义差异法(LSD法)分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结　　果

　　2.1 GCDC对HL7702细胞形态的影响 终浓度为150μmol/L的GCDC作用HL7702细胞24h后，光镜下对照组细胞形态未见变化，而处理组细胞可见典型的凋亡形态学改变，表现为细胞体积缩小，胞浆中出现空泡，核染色质浓缩、碎裂，并可见凋亡小体(图1)。

　　2.2 细胞凋亡率的变化 不同浓度的GCDC均能诱导HL7702细胞凋亡，细胞凋亡率(包括早期凋亡与晚期凋亡细胞)与GCDC呈浓度依赖性(表2、图2)。

　　2.3 细胞内钙离子浓度的变化 GCDC处理HL7702细胞后，细胞内钙离子的MFI不同程度升高(P<0.05)，并且与GCDC呈浓度依赖性(表2)。

　　2.4 GCDC对HL7702细胞Bcl2、Bax mRNA表达的影响 不同浓度GCDC诱导HL7702细胞凋亡后，Bcl2 mRNA表达水平减弱，Bax mRNA表达水平明显增强，与阴性对照组相比具有显著性差异(P<0.05)(表3、图3、图4)。表2 GCDC对HL7702细胞凋亡率和钙离子浓度的影响表3 GCDC对HL7702细胞Bcl2、Bax mRNA表达的影响

3 讨　　论

　　细胞凋亡是某些因素诱导的基因介导的细胞自杀行为，越来越多的研究表明细胞凋亡在胆汁淤积性

　　0: control; 1: 100μmol/L GCDC; 2: 150μmol/L GCDC; 3: 200μmol/L GCDC ; 4: 250μmol/L GCDC; M: DNA marker肝病的发展过程中发挥重要作用[2]。胆汁酸是胆固醇的生理代谢产物，胆汁酸分为疏水性和亲水性两种，胆汁酸的细胞毒性作用与其疏水性密切相关。国外研究表明，高浓度的胆汁酸(500～1000μmol/L)主要通过诱导细胞坏死途径损伤肝脏；而低浓度的胆汁酸(25～250μmol/L)通过凋亡诱导途径对肝脏产生毒性作用[3]。GCDC是体内的主要疏水性胆汁酸。本实验以低浓度的GCDC(100～250μmol/L)诱导体外培养的人正常肝细胞株HL7702，通过流式细胞Annexin VFITC/PI双染色法检测细胞凋亡率，结果显示，GCDC能诱导HL7702凋亡，细胞凋亡率与GCDC呈浓度依赖性。

　　细胞凋亡是由一个十分复杂的信号传导通路所调控。钙是细胞内的主要第二信使，钙的升高参与了凋亡早期信号转导和凋亡的执行阶段，而更重要的是在凋亡的早期阶段[4]。本实验结果显示，GCDC在引起HL7702细胞凋亡时，能使细胞内钙离子浓度显著增加，钙离子的增加与GCDC呈浓度依赖性。说明GCDC诱导细胞凋亡与GCDC引起细胞内钙离子浓度的变化有着直接关系。细胞质内钙离子升高后，一方面使得许多钙依赖的酶被激活，如激活钙调蛋白分解酶、钙调神经磷酸酶等，钙调蛋白分解酶可直接激活Bax、Bid等促凋亡蛋白，进一步激发线粒体膜间质蛋白的释放而间接调控凋亡[5]；另一方面，细胞质内钙离子浓度的升高会导致钙离子转移到线粒体，引起线粒体损伤，释放细胞色素C，导致细胞凋亡[6]。

　　Bcl2基因是从滤泡性B淋巴细胞分离出来的一种癌基因。Bcl2家族成员在程序性细胞死亡中起关键作用，Bcl2家族蛋白广泛分布在线粒体外膜、核膜和内质网膜上。根据它对凋亡的促进或抑制作用分为两大类：抑制凋亡的家族成员，包括Bcl2、Bclxl等；促进凋亡的成员，如Bax、BclXs、Bad、Bak、Bik/nbk、Bid和Harakiri等。Bcl2和Bax可形成同二聚体或异二聚体来改变线粒体的通透性，从而决定细胞的生存或死亡[7]。Bcl2可与促凋亡Bax形成二聚体，如果Bax相对量高于Bcl2，则Bax同二聚体的数量增多，从而促进细胞凋亡；而如果Bcl2相对量高于Bax，则促进形成Bcl2/Bax异二聚体，并使Bcl2同二聚体的量增多，从而抑制细胞凋亡。在本实验中，我们应用RTPCR同时检测了Bcl2、Bax的mRNA表达水平，分析结果显示，GCDC能明显抑制Bcl2 mRNA表达，且上调Bax mRNA表达，使Bax同二聚体的数量增多，从而诱导细胞凋亡。

　　本研究结果显示，GCDC能同时使HL7702细胞内钙离子浓度增加、抑制Bcl2 mRNA表达，且上调Bax mRNA表达。提示HL7702细胞内钙离子和Bcl2家族基因在细胞的凋亡调控中共同发挥重要作用。但是，各因素是如何相互调节、相互关联仍需要进一步的深入研究。

参考文献

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