尼古丁对巨噬细胞肝X受体α表达及胆固醇外流的影响

　　　　 作者：钱宗杰，曾秋棠，邱龄，肖传实

【摘要】 　　目的 通过研究尼古丁对巨噬细胞的肝X受体α(LXRα)及其下游的基因表达和胆固醇外流的影响，探讨尼古丁对LXR信号系统的作用。方法 分离人外周血单核细胞，并转化为巨噬细胞。在尼古丁的作用下，观察巨噬细胞的aopAⅠ介导的胆固醇外流的变化和LXR及其下游一些基因mRNA表达。结果 尼古丁显著影响巨噬细胞中一些涉及胆固醇代谢及炎症反应的基因表达，同时降低aopAⅠ介导的胆固醇外流。结论 尼古丁影响巨噬细胞LXR信号途径，促进泡沫细胞形成，使动脉粥样硬化发生发展。

【关键词】 尼古丁；胆固醇外流；巨噬细胞；肝X受体

　　ABSTRACT: Objective To investigate the characteristics of liver X receptor alfa (LXRα) and its target gene expression as well as cholesterol efflux from human macrophages under nicotine. Methods Human monocytederived macrophages were collected. Before apoAImediated human monocytederived macrophage cholesterol efflux， and mRNA expression of LXRα and some of its target genes being detected， the macrophages were induced with or without nicotine. Results Preincubation of human monocytederived macrophages with nicotine，cholesterol efflux was suppressed to apolipoprotein AI. Nicotine also inhibited LXRα and some of its target genes mRNA expression involved cholesterol metabolism， and facilitated expression of some inflammatory genes. Conclusion Nicotine can regulate foam cell formation by inhibiting LXR pathway and produce atherogenesis.

　　KEY WORDS: nicotine; cholesterol efflux; macrophage; liver X receptor

　　动脉粥样硬化的早期病变为血管内皮下富含胆固醇的巨噬细胞聚集，并在各种复杂的机制下，巨噬细胞在动脉壁转变为泡沫细胞，从而启动动脉粥样硬化病变的发生。在巨噬细胞内部，肝X受体(liver X receptor， LXR)及LXR诱导的信号是介导其脂代谢的重要分子基础，也是巨噬细胞的致动脉粥样硬化的重要环节[1]。

　　尼古丁(nicotine)被认为是烟草中致动脉粥样硬化的一种重要成分，但对其致病机制还知之甚少。Lau等[2]用LDLR-/-小鼠模型，经过尼古丁处理，发现动脉壁局部病变明显增大，一些核因子κB(nuclear factor κB， NFκB)的目的基因表达上调，表现为增强的炎症效应；来自于腹腔的巨噬细胞也呈现这种变化。所以，尼古丁的致动脉粥样硬化作用与其炎症效应相关。本研究旨在探讨尼古丁对LXR信号途径的影响以及对巨噬细胞的胆固醇外流中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与试剂

　　21名健康成人外周血液，提取外周血单核细胞作为本研究的实验材料。Ficoll淋巴细胞分层液、20g/L锥虫蓝染液、小牛血清、二甲基亚砜(DMSO)、0.2g/L EDTA(武汉亚法生物公司)，完全RPMI1640培养液(Gibco公司)，[3H]胆固醇、apoAⅠ、TO901317(Sigma公司)，佛波酯(phorbol 12myristate 13acetate，PMA)(Alexis Biochemicals公司)，Trizol试剂(Promega公司)，用于RTPCR的试剂和Marker DL2000(TaKaRa Biotrchology公司)，尼古丁(中山生物公司)。

　　1.2 外周血单核细胞的分离

　　抽取患者动脉血10mL，采用Ficoll(密度1.077g/L)密度梯度离心法分离收集外周血单个核细胞。以1×107/mL细胞浓度加入6孔细胞培养板，每孔2mL，置37℃，50mL/L CO2贴壁培养2h，收集贴壁的细胞，姬姆萨染色纯度90%以上，20g/L锥虫蓝染液染色示细胞活力95%以上。

　　1.3 巨噬细胞的转化

　　按文献[3]，将收集的单核细胞调整为3.0×106/mL，转入6孔培养板，在含有100mL/L小牛血清，青霉素100u/mL，链霉素100μg/mL的RPMI 1640培养液，加3.2×10-7mol/L PMA，50mL/L CO2，37℃的培养箱中孵育24h。

　　1.4 巨噬细胞的处理及胆固醇外流的测定

　　根据文献[1，4]，100μg/L的尼古丁对巨噬细胞的免疫信号途径发挥作用，而无明显的细胞毒作用，2μmol/L的TO901317对LXR的激动作用最佳，故以样本中加终浓度0、100μg/L的尼古丁和同时加或不加2μmol/L的TO901317进行分组。
　　
　　参照文献[5]描述的方法，将巨噬细胞调整为3.0×106/mL的密度，转入6孔细胞培养板，在含有100mL/L小牛血清，青霉素100u/mL，链霉素100μg/mL的RPMI 1640培养液中加0.2μCi/L[3H]胆固醇共培养48h，用PBS液洗涤细胞。获得的巨噬细胞调整为3.0×106/mL并转入6孔细胞培养板，在上述培养液中，按分组要求加入试剂，培养24h。再用PBS 液洗涤细胞，在无血清含10μg/L apoAⅠ新培养液中培育细胞12h，用闪烁计数法检测培养液和细胞的[3H]胆固醇。胆固醇流出用[培养液中CPM(每分钟记数)/总CPM]×100% 来表示。

　　1.5 逆转录聚合酶链反应

　　收集上述各组细胞。按Trizol试剂盒说明书提取总RNA。取各组细胞总RNA 2μg逆转录合成cDNA，再取逆转录产物10μL进行PCR循环。94℃预变性5min，PCR扩增34个循环(94℃变性1min，退火1min，72℃延伸1min)后，72℃再延伸10min，然后4℃ 5min。PCR引物由武汉伯杰生物公司合成，引物序列见表1。反应结束后，取反应产物10μL进行15g/L琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，UVP型凝胶图像分析系统摄图，并分析各组目的基因及GAPGH基因灰度值，以二者的比值代表各基因的表达量。表1 RTPCR时各引物上游及下游的序列（略）

　　1.6 统计学分析

　　应用SAS 统计分析软件分析各组数据。结果以(±s)表示，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 尼古丁对巨噬细胞胆固醇外流的影响

　　100μg/L的尼古丁作用可显著降低apoAⅠ介导的人外周血来源的巨噬细胞胆固醇外流。另一方面，巨噬细胞在有TO901317活化LXR时，促进细胞胆固醇外流，但可被尼古丁(100μg/L)明显降低(表2)。表2 尼古丁对apoAⅠ介导的巨噬细胞胆固醇外流的影响（略）

　　2.2 尼古丁对人外周血来源的巨噬细胞LXRα及下游基因mRNA表达的影响

　　在尼古丁的作用下，人外周单核细胞来源的巨噬细胞，其涉及胆固醇外流的基因LXRα、ATP结合盒转移子家族A1(ATP binding cassette A1， ABCA1)、胆固醇调节元件结合蛋白2(sterol regulatory element binding protein， SREBP2)、磷脂转运蛋白(phospholipid transfer protein， PLTP)、apoE、胆固醇酯转运蛋白(cholesterol ester transfer protein， CETP)的mRNA表达均下调。在本研究中的巨噬细胞，无论有无尼古丁的刺激，在有LXR激活剂TO901317的作用下，ABCA1、SREBP2、PLTP、apoE和CETP的mRNA表达上调。而尼古丁可使MMP9、MIP1α等有关炎症反应的基因mRNA表达水平增高，TO901317使其表达下调(表3，图1)。表3 尼古丁对巨噬细胞LXRα及其目的基因表达的影响（略）

　　3 讨 论

　　动脉粥样硬化病变的特征是动脉壁内的脂代谢改变并使血管壁呈现慢性炎症表现。动脉粥样硬化的形成首先是循环中的单核细胞进入血管内皮下间隙并分化为巨噬细胞。当氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein， oxLDL)或经修饰的LDL存在时，这些巨噬细胞就积聚胆固醇酯而转化为泡沫细胞。当刺激动脉壁中巨噬细胞，促使其胞内胆固醇外流转化成HDL，可抑制泡沫细胞形成，阻止动脉粥样硬化的发生和发展。

　　LXR属核受体超家族的配体激活转录因子，其成员有LXRα(NR1H3)和LXRβ(NR1h3)。LXR与视黄酸核受体(retinoic acid receptor， RXR)以杂二聚体形式存在，胆固醇的一些代谢产物是其内源的激活配体，人工合成的GW3965、TO901317是其特异的激活剂。LXR通过直接结合在靶基因的DR4(direct repeat four)序列位点，即LXR反应元件(LXR response element， LXRE)，调节靶基因的表达，通过与共刺激因子或共抑制因子的相互作用来发挥刺激或抑制目的基因表达。近几年来的研究表明，许多涉及脂代谢平衡、炎症及免疫反应的基因均接受LXR的调节[1]。巨噬细胞中，LXR被内源性配体激活后，调节巨噬细胞脂代谢平衡；同时，激活LXR也可抑制一些致炎基因的表达[6]。本研究发现，体外培养的人巨噬细胞，刺激LXR信号，上调涉及脂代谢基因表达，如ABCA1、SREBP2、PLTP、apoE和CETP等，可促进巨噬细胞的胆固醇外流；相反涉及炎症反应的基因MMP9、MIP1α则表达下调。

　　在巨噬细胞内，通过协同调节介导胆固醇摄入、储积、细胞内合成和外流，来维持胆固醇平衡，当调节这些功能的信号出现故障，可能导致泡沫细胞的形成[7]。而巨噬细胞内的炎症因子活化，则是泡沫细胞形成和动脉粥样病变进展的直接原因。

　　吸烟是动脉粥样硬化的危险因子，尼古丁是其中主要的有害成分。尼古丁被认为可以致动脉粥样硬化的因素之一，但是它的具体机制并不很清楚，目前在炎症和免疫机制方面有一些研究结果。如Heeschen等[8]研究发现，尼古丁促进动脉粥样斑块病变的进展，导致心脏的缺血事件发生。另外，Aicher等[9]研究发现，尼古丁活化病变处包括单核细胞等抗原提呈细胞，主要活化ERK1/2、p38MAPK和Akt，导致这些抗原提呈细胞启动先天性或获得性免疫功能，也分泌大量的炎症因子，参与免疫和炎症反应，最终导致动脉粥样硬化的进展。在LDLR-/-小鼠模型，Lau等[2]研究发现，尼古丁促进巨噬细胞分泌炎症因子致动脉粥样硬化，这种作用可能是尼古丁通过尼古丁乙酰胆碱(nicotinic acetylcholine， nACh)受体直接诱导单核细胞和巨噬细胞的iNOS和TNFα表达；浸入病变局部的活化巨噬细胞，在其分泌的炎症因子和氧化负荷等机制作用下，活化巨噬细胞、平滑肌细胞和内皮细胞中的NFκB转录因子；尼古丁刺激NFκB的目的基因后，首先活化VCAM1和COX2，随后是PDGFβ。这些生物活性物质对炎性细胞浸润、平滑肌细胞的迁移和增殖有重要作用，从而促进动脉粥样斑块病变的进展 [5]。脂代谢异常是动脉粥样硬化主要因素，尼古丁对于脂代谢影响的相关研究并不多，仅有报道尼古丁能抑制CETP和PLTP的活性[10]。本研究中，发现尼古丁可通过抑制LXR信号途径，即下调如ABCA1、SREBP2、PLTP、apoE和CETP等基因表达，影响巨噬细胞的胆固醇外流，并可通过LXR途径来促进炎症的发生，这可能是吸烟能致动脉粥样硬化的一个方面。

参考文献

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