作者：岳进，郭大刚，孙翔，雷德林，毛天球
【摘要】 目的 评价“SrHPO4/Ca4(PO4)2O/CaHPO4”系掺锶磷灰石骨水泥的生物相容性及其与掺锶量的关系。方法 通过急性全身毒性、热原性、溶血性、体外细胞毒性以及成骨细胞在材料表面的黏附、增殖与表达等实验，检测材料的性能及生物降解潜能。结果 “SrHPO4/Ca4(PO4)2O/CaHPO4”系掺锶磷灰石骨水泥的急性全身毒性、热原性、溶血性、体外细胞毒性均为合格。Sr-CPC的热原性、溶血性以及碱性磷酸酶值与掺锶量呈非线性关系。结论 含锶磷酸钙骨水泥体外细胞生物相容性良好，是安全的新型骨组织工程支架材料。
【关键词】 掺锶磷灰石骨水泥 生物相容性 成骨细胞 成纤维细胞
ABSTRACT: Objective To investigate the biocompatibility of Sr-containing calcium phosphate cement series ［SrHPO4/Ca4(PO4)2O/CaHPO4］. Methods A series tests， including acute systemic toxicity test， pyrogen test， hemolysis test， cytotoxicity test and in vitro biological behavior of osteoblasts， were designed to evaluate the cytobiology of the material. Results Sr-containing calcium phosphate cement had excellent biocompatibility and all of the biological evaluation tests were up to the standard. Pyrogen test， hemolysis test and ALP value of Sr-containing calcium phosphate cement behavior had non-linear relationships with the Sr-doped content. Conclusion Sr-containing calcium phosphate cement series are good in biocompatibility and can be widely used in tissue engineering research.
KEY WORDS: Sr-containing calcium phosphate cement; biocompatibility; osteoblast; fibroblast
羟基磷灰石(hydroxyapatite， HAP)块体陶瓷虽然具有良好的生物相容性与生物活性，但降解极其缓慢［1］。While等［1］报道HAP植入体内后年降解率不高于10%。为了改善其降解性，人们做了大量研究工作，认为通过在HAP人工骨结构中建造宏观孔洞［2-3］，降低钙/磷元素比率［4］， HAP晶格引入碳酸根等［5-6］方法可以改善这类材料的降解性。然而，这些方法对其抗压强度不利或者无积极作用。
近年来的大量研究表明，锶取代钙掺入磷灰石后对其性能产生重要影响，不仅改善了生物相容性［7］、生物活性［8］、骨传导性［7］，还协同提高了其降解速率［9-10］与力学性能［11-12］。此外，低剂量Sr还具有促进骨形成、抑制骨吸收［13］、治疗骨癌与骨痛等［14］生物学效能。最近，国内西安交通大学［10-11， 15］发明了由磷酸氢锶(SrHPO4)、磷酸四钙(Ca4(PO4)2O)、磷酸氢钙(CaHPO4)组成的掺锶磷灰石骨水泥(Sr-containing calcium phosphate cement， Sr-CPC)，并对其微观结构、理化性能等方面进行了系统深入的研究。作为合作研究，本文系统考察了Sr-CPC水化产物的急性全身毒性、热原性、溶血性、体外细胞毒性以及成骨细胞在材料表面的黏附、增殖与表达等一系列体外细胞生物学性能，并探讨了掺锶量对这些性能的影响规律，为今后材料的进一步改进并应用于医学领域奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
本实验试样是Sr-CPC水化产物，为白色粉末(过100目ASTM筛)，由西安交通大学金属材料强度国家重点实验室提供，固化前的初始原料与配方见表1，制备方法见文献［11］。各试样测试前采用紫外线照射灭菌3 h备用。表1 植入材料的编号与相应成分（略）
1.2 急性全身毒性实验
随机取ICR品系小白鼠12只，体重18-21 g，雌雄各半，均分为实验组和对照组。将每组材料各3.0 g加入生理盐水30 mL，37 ℃浸提4 h后，经0.22 μm微孔滤膜过滤，制成100 g/L浸提液。无菌条件下分别向实验组和对照组的小鼠腹腔内以每克体重0.1mL剂量注射浸提液或生理盐水，14 d内观察2组小鼠一般状况和死亡情况，第14天脱椎处死，解剖观察2组小鼠各主要脏器的变化。
1.3 溶血实验
实验用新西兰白兔1只，体重2.4 kg。心脏穿刺抽取兔血2 mL，立即加入20 g/L的草酸钾生理盐水溶液0.1 mL，混合抗凝。取新鲜抗凝兔全血2 mL，加入2.5 mL生理盐水，稀释备用。
每次分别称取灭菌备用的Sr-CPC0、Sr-CPC1、Sr-CPC2粉末0.5 g，共5次，各自加入盛有4 mL生理盐水的15个试管中，编号后作为实验组；阳性对照组为5个空试管内各加入1 g/L碳酸钠溶液4 mL。各试管在37 ℃水浴1 h后，分别加入1 mL抗凝兔血，轻摇。37 ℃水浴3 h后，以1 000 r/min速度离心5 min，取上清液，置入比色皿中，用分光光度计在540 nm波长处测其光吸收度，计算材料溶血率。溶血率计算方法：
溶血率=A实验材料-A阴性对照A阳性对照-A阴性对照
1.4 热原实验
健康成年新西兰白兔9只，体重1.7-3.1 kg，雌兔无孕，预测体温进行筛选。
采用预试检查合格的生理盐水注射液为浸提介质，按材料3.0 g与生理盐水30 mL的比例制取浸提液。
实验用兔在实验前1-2 d处于同一环境中，实验室和饲养室温差不大于5 ℃，一次实验全过程室温变化不大于5 ℃。测定家兔正常体温时，将家兔装于固定器内，防止骚动，30 min后开始第1次测温。将肛门体温计插入兔肛门，深度约6 cm，每兔的测温时间至少2 min。符合要求后15 min内，耳缘静脉缓慢注入材料浸提液，剂量为10 mL/kg，浸提液温度为38 ℃，注射完毕每隔1 h测温1次，共测3次，以3次体温中最高1次减去正常体温，即为该兔体温升高度数，根据标准对结果进行评定。
1.5 体外细胞毒性评价
选用传代48-72 h生长旺盛的L-929细胞系(小鼠成纤维细胞，第四军医大学口腔生物学教研室提供)。DMEM-BFS培养液培养，待细胞长满培养皿后，2.5 g/L胰蛋白酶消化单层培养细胞，使用培养液中止消化，稀释，然后将细胞按浓度1×104/mL接种到96孔板中，每孔重复5遍，共接种细胞悬液200 μL。
浸提介质为新鲜配制的DMEM-BFS培养液，pH=7.2。将三组试样粉末分别与浸提介质按1 g/10 mL比例配制，然后置入CO2浓度为50 mL/L的饱和湿度孵箱中浸提，48 h后待用，温度均为37 ℃。
将上述三种浸提液分别稀释成100%、50%、25%、10%四种系列浓度的液体，阳性对照为6.4 mL/L苯酚，阴性对照为单纯细胞培养液。细胞贴壁24 h后，移去上清液，取上述实验组及阴性、阳性对照组，各加入200 μL接种细胞悬液，置于CO2浓度为50 mL/L的饱和湿度孵箱培养，温度均为37 ℃。细胞分别培养1、3、5 d后，取出浸提液与L929细胞作用的培养板，每孔加入浓度为5 g/L的MTT溶液20 μL，继续在饱和湿度孵箱中孵育4 h，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μL DMSO(dimethyl sulfoxide)，震荡10 min，在酶联免疫仪490 nm波长下测定各孔光吸收值(A值，用单纯培养液调零，A1)，取平均值。计算细胞相对增殖率(relative growth rate， RGR)，按六级毒性分级法确定材料毒性。
RGR (%)=A实验组A阴性对照组×100%
1.6 幼兔成骨细胞在掺锶磷酸钙骨水泥表面的黏附、增殖与表达
通过相差显微镜，扫描电镜观察幼兔成骨细胞在梯度含锶磷酸钙骨水泥表面的黏附情况。增殖情况参考MTT比色法检测的细胞相对增殖率。幼兔成骨细胞的表达采用碱性磷酸酶活性检测法检测。
将掺锶量不同的三种材料分别制成大小为4 mm×4 mm×2 mm的圆片状，超声波清洗后烘干、灭菌，DMEM 完全培养基预湿备用。将第3代幼兔成骨细胞(种植密度5×104/孔)种植后置于6孔板培养皿培养。以不加材料、放置盖玻片后种植的成骨细胞作为对照，分别进行相差显微镜观察和扫描电镜观察。另将第3代幼兔成骨细胞(种植密度5×104/孔)与三种材料复合置于24孔板中培养作为实验组，以单独培养的成骨细胞作为对照，对此五组进行细胞增殖与ALP活性检测。
通过相差显微镜(Olympus IX70)逐日观察幼兔成骨细胞在梯度含锶磷酸钙骨水泥表面的黏附情况，扫描电镜观察。成骨细胞/材料复合后第5天取出，用25 mL/L的戊二醛固定、系列丙酮脱水、乙酸异戊酯置换，临界点干燥，表面喷金后扫描电镜观察。
采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase， ALP)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，按照测定孔、标准孔、空白孔分组，测定孔中加入浸提液5 μL，标准孔加入0.1 mg/mL 酚标准液5 μL，空白孔加入双蒸水5 μL。然后再分别加入缓冲液50 μL，基质液50 μL，充分混匀后37 ℃水浴15 min，再分别加入显色剂150 μL，立即混匀，酶联免疫检测仪520 nm波长下测定各孔光吸收值(A值，用空白管调零)。
2 结果与分析
2.1 急性全身毒性实验
注射后14 d内，2组小鼠毛发光泽，活动正常，食欲较好，体重增加，未发现任何毒性反应及死亡。14 d处死，解剖观察心、肝、肺、肾、胃、肠等主要脏器，未见异常改变，表明Sr-CPC0、Sr-CPC1、 Sr-CPC2三种材料按毒性分级属于无毒级。
2.2 溶血实验
实验组均未出现溶血现象，离心后上层为清亮无色液体，下层为样品颗粒及红细胞沉淀物。涂片镜检未见红细胞破裂、凝聚现象。表2列出了各材料以及阳性、阴性对照组的光吸收度与相应的溶血率计算结果。Sr-CPC0、Sr-CPC1、Sr-CPC2的溶血率分别是(3.19±0.38)%、(0.98±0.43)%、(1.22±0.65)%，均小于临床要求溶血率低于5%的标准。这说明了各测试样品的溶血率均符合要求，其中掺锶组表现出比未掺锶组更低的溶血率，而且在掺锶组中，Sr-CPC1的溶血率最低。表2 不同实验组的光吸收度数据与溶血率的计算结果（略）
2.3 热原实验
从各材料浸提液注入兔耳缘静脉后的温度变化(表3)中可以看出，注入体内后1-3 h，9只家兔体温升高均在0.6 ℃以下，且9只家兔温度升高总数均在1.3 ℃以下，符合热原检测规定，说明材料无致热作用。表3 各材料浸提液注入兔耳缘静脉后的温度变化（略）
2.4 体外细胞毒性实验
小鼠成纤维细胞在各试样粉末浸提液中的相对增殖率与毒性评价结果如表4所示。可以看出，与阴性对照组相比，L929细胞在各材料的100%浓度浸提液里，细胞相对增殖率均在90%以上，毒性均为1级，实验结果受材料掺锶量与观察时间影响不显著。逐步稀释各浸提液后，细胞相对增殖率稍有增加，绝大多数在100%以上，相应毒性大都为0级，受观察时间影响不大。
通过比较，Sr-CPC2的细胞增殖率比Sr-CPC0更佳。结论：三种材料具有良好且稳定的细胞增殖率，未表现出细胞毒性，掺锶最多的Sr-CPC2组的细胞相对增殖率最高。表4 各材料浸提液与L929细胞作用1 d、3 d与5 d 后的细胞相对增殖率与细胞毒性评价（略）
2.5 幼兔成骨细胞在材料表面的黏附、增殖与表达
兔成骨细胞分别在Sr-CPC0、Sr-CPC1、Sr-CPC2表面培养5 d后黏附状况的扫描电镜照片见图1。由图1A可以看出，材料表面成骨细胞数量较少，部分贴壁生长、分泌基质，并开始侵蚀、破坏材料，破坏范围小，程度轻。由图1B与图1C可以看出，材料表面成骨细胞数量较多，有分泌功能且分泌多量基质，细胞数量及功能与Sr-CPC0组有差别。Sr-CPC2表面可见较多细胞侵蚀破坏(图1C)。
Sr-CPC0、Sr-CPC1、Sr-CPC2三种试样浸提液与对照组经成骨细胞碱性磷酸酶检测的结果如表5所示。碱性磷酸酶是成骨细胞分化的主要功能活性酶，是成骨细胞分化成熟的重要标志之一，富含于胞质中，常被用来鉴别成骨细胞［16］。 通过测量细胞分泌的碱性磷酸酶活性的相对强弱来表示细胞在材料表面的活性表达。由表5可以看出，三种试样浸提液的碱性磷酸酶活性由高至低依次为Sr-CPC1、Sr-CPC2、Sr-CPC0，说明了掺锶组较之未掺锶组具有更高的成骨活性，而在掺锶组中，Sr-CPC1的成骨活性比Sr-CPC2更高。表5 成骨细胞碱性磷酸酶检测结果（略）
3 讨论
已有研究表明，Sr-CPC的理化性能与其掺锶量有重要关系［10-12，17］。在掺锶磷灰石(Sr-HA)陶瓷的研究工作中，也发现其力学性能、降解性能与其掺锶量密切相关［9， 18-19］。因此，本文从细胞生物学角度，进一步探讨Sr-CPC的细胞生物学性能及其与掺锶量的相关性确属必要。
本实验研究表明，Sr-CPC无明显体外细胞毒性与急性全身毒性。Sr-CPC热原性、溶血性、体外细胞毒性以及ALP值均与掺锶量有紧密联系。其中，Sr-CPC的热原性、溶血性以及ALP值与掺锶量呈非线性关系：掺锶组(Sr-CPC1、Sr-CPC2)的热原性、溶血性以及ALP值均优于未掺锶组(Sr-CPC0)，在掺锶组中，Sr-CPC1的这些性能又优于Sr-CPC2。综合分析幼兔成骨细胞在掺锶磷酸钙骨水泥表面的黏附、增殖与表达实验结果可知：成骨细胞在三种不同骨水泥材料表面均有黏附、增殖及表达，但程度有所不同。Sr-CPC1、Sr-CPC2更加适合成骨细胞的黏附与增殖，碱性磷酸酶表达也更加明显，二者镜下差异不明显。Sr-CPC0表面成骨细胞黏附较少，增殖不活跃。电镜照片显示Sr-CPC1、Sr-CPC2材料表面较多的细胞、小颗粒，提示细胞黏附数量多，材料溶解、破坏重，提示加入适量(5%-10%)Sr可以改善CPC的溶解动力学，提高其生物降解性。这些结果暗示了掺锶量不仅是调控Sr-CPC理化性能的关键因素，而且也是影响其体外细胞生物学性能的重要因素。由西安交通大学自主研制的“SrHPO4/Ca4(PO4)2O/CaHPO4”系掺锶磷灰石骨水泥(Sr-CPC)是一种优良的新型骨修复材料体系，具有良好的理化性能。目前，掺锶量对Sr-CPC、Sr-HA陶瓷理化性能的影响机制尚处于推测之中［19］，因而解释掺锶量对Sr-CPC体外细胞生物学性能的影响机制仍需进一步研究。
“SrHPO4/Ca4(PO4)2O/CaHPO4”系掺锶磷灰石骨水泥的急性全身毒性、热原性、溶血性、体外细胞毒性均为合格。Sr-CPC的热原性、溶血性以及ALP值与掺锶量呈非线性关系，但其影响机制仍需进一步研究。
参考文献
［1］While E， Sors EC. Biomaterial aspects of Interpore-200 porous hydroxyapatite ［J］. Dental Clinics of North America， 1986， 30(1):49-67.
［2］Xu HHK， Eichmiller FC， Giuseppetti AA. Reinforcement of a self-setting calcium phosphate cement with different fibers ［J］. J Biomed Mater Res， 1999， 52(3):107-114.
［3］Chang BS， Lee CK， Hong KS， et al. Osteoconduction at porous hydroxyapatite with various pore configurations ［J］. Biomaterials， 2000， 21(12):1291-1298.
［4］Takagi S， Chow LC. Formation of macropores in calcium phosphate cement implants ［J］. J Mater Sci: Mater Med， 2001， 12(2):135-139.
［5］Wang HB， Jong K， Moursi A， et al. Ca/P ratio effects on the degradation of hydroxyapatite in vitro ［J］. J Biomed Mater Res， 2003， 67(2):599-608.
［6］Tang RK， Henneman ZJ， Nancollas GH. Constant composition kinetics study of carbonated apatite dissolution ［J］. J Cry Grow， 2003， 249(3):614-624.
［7］Wrong CT， Chen QZ， Lu WW， et al. Ultrastructural study of mineralization of a strontium-containing hydroxyapatite (Sr-HA) cement in vivo ［J］. Biomed Mater Res， 2004， 70(3):428-435.
［8］Xue WC， Moore JL， Hosick HL， et al. Osteoprecursor cell response to strontium-containing hydroxyapatite ceramics ［J］ . J Biomed Mater Res， 2006， 79(4):804-814.
［9］Christoffersen J， Christoffersen MR， Kolthoff N. Effects of strontium ions on growth and dissolution of hydroxtapatite and on bone mineral detection ［J］. Bone， 1997， 20(1):47-52.
［10］岳进，毛天球，雷德林，等．仿生合成梯度含锶磷酸钙骨水泥的体外细胞生物学性能检测 ［J］. 中国组织工程研究与临床康复， 2008， 12(1):23-26.
［11］Guo DG， Xu KW， Han Yong， et al. Development of a strontium-containing hydroxyapatite bone cement ［J］. Biomaterials， 2005， 26(19):4073-4083.
［12］郭永锦， 张 敏， 陈治清. 锶离子对α-磷酸钙骨水门汀改性的研究［J］. 北京口腔医学， 2004， 12(2):73-76.
［13］Chapuy MC， Meunier PJ. Prevention and treatment of osteoporosis (see comments) ［J］. Aging (Milano)， 1995， 7(4):164-173.
［14］Dunn I， Kirk D ， Roberts JT， et al. Strontium 89 in early relapse of hormone treated metastatic prostate cancer: efficacy， natural history and prognosis ［J］. ANZ J Surg， 2004， 74(4):A10.
［15］郭大刚，徐可为，憨勇. 含锶纳米磷酸钙生物活性骨水泥的制备工艺. 中国：ZL200410025920.5［P］. 2005-01-05.
［16］Batra P， Kharbanda OP， Duggal R， et al. Alkaline phosphatase activity in gingival crevicular fluid during canine retraction ［J］. Orthodontics & Craniofacial Research， 2006， 9 (1):44-51.
［17］赵晓云，郭大刚，憨勇，等. 含锶磷酸钙骨水泥的制备及性能研究 ［J］. 无机材料学报， 2005， 20(5):1167-1173.
［18］陈德敏，傅远飞，顾国珍，等. 掺锶羟磷灰石固溶体的制备及离解度测定 ［J］. 中国生物医学工程学报， 2001， 20(3):278-280.
［19］陈德敏，傅远飞. 不同含锶量的掺锶羟基磷灰石固溶体机械性能评价 ［J］. 口腔材料器械杂志. 2001， 10(4):178-179.