作者：陈瑞琳，蔺淑梅，张树林，叶峰，张曦，赵英仁
【摘要】 目的 探讨慢性乙肝病毒(HBV)感染者干扰素-γ(IFN-γ)的表达水平及其影响因素。方法 采用实时定量RT-PCR技术和ELISA法分别检测慢性HBV感染者外周血单个核细胞(PBMCs)中IFN-γ mRNA的表达和血清IFN-γ的分泌水平；巢式PCR技术检测PBMCs中HBV DNA。结果 慢性HBV感染者IFN-γ的表达和分泌水平均明显低于对照组(P<0.01，P<0.05)；慢性HBV携带者IFN-γ的表达和分泌水平均显著低于HBeAg阳性组(P均<0.05)和HBeAg阴性组(P均<0.01)；HBeAg阳性组IFN-γ的表达和分泌水平均明显低于HBeAg阴性组(P均<0.01)；PBMCs中HBV DNA阳性组IFN-γ的表达和分泌水平均明显低于HBV DNA阴性组(P均<0.01)；IFN-γ表达和分泌水平与血清HBV DNA水平均呈负相关(P均<0.01)。结论 慢性HBV感染者IFN-γ低表达；高病毒载量可抑制IFN-γ的表达。
【关键词】 乙型病毒性肝炎 乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA) 外周血单个核细胞 干扰素-γ(IFN-γ)
ABSTRACT: Objective To study the expression of interferon-γ (IFN-γ) in peripheral blood monocytes (PBMCs) in patients with chronic HBV infection and factors that may affect its expression. Methods The expression of IFN-γ mRNA and secretion of IFN-γ in chronic HBV infectious patients were determined by real-time RT-PCR and ELISA， respectively; HBV DNA in PBMCs was detected by nested-PCR. Results The expression and secretion of IFN-γ were all significantly lower in chronic HBV infectious patients than in controls (P<0.01， P<0.05). The expression and secretion of IFN-γ were all obviously lower in chronic HBV carriers than in HBeAg positive group (P<0.05， P<0.05) and HBeAg negative group (P<0.01， P<0.01). The expression and serection of IFN-γ were all significantly lower in HBeAg positive group than in HBeAg negative group (P<0.01， P<0.01). The expression and secretion of IFN-γ showed significantly lower level in HBV DNA from PBMCs positive group than in HBV DNA negative group (P<0.01， P<0.01); the expression and secretion of IFN-γ were negatively correlated with the amounts of HBV DNA in serum (P<0.01， P<0.001). Conclusion The expression of IFN-γ in chronic HBV infectious patients was lower; high amounts of HBV DNA may inhibit the expression of IFN-γ.
KEY WORDS: viral hepatitis B; HBV DNA; peripheral blood monocyte; interferon-γ(IFN-γ)
多年来研究认为，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus， HBV)感染慢性化是机体免疫功能紊乱，主要是细胞免疫功能低下所致。干扰素-γ(IFN-γ)主要由活化的Th1细胞、NK细胞产生，是一个重要的免疫反应调控因子，其活性水平直接反映了Th1细胞的功能，与HBV感染后的结局密切相关。以往大多研究是从慢性乙型肝炎(CHB)临床分型角度来研究IFN-γ的表达，未考虑病情轻重及病程长短对检测结果的影响［1-4］，因而检测结果不一。此外，我们在临床上经常观察到免疫刺激治疗对高病毒载量CHB患者疗效甚差，而IFN-γ又与乙肝病毒(HBV)清除关系密切，故我们从乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA)的角度来研究IFN-γ，探讨相同临床分型和相近病程的90例慢性HBV感染者IFN-γ的表达。
1 材料与方法
1.1 研究对象
选取2007年1月至2007年7月在本院感染科门诊就诊和住院的慢性HBV感染者共90例，诊断符合2000年中华医学会西安会议修订的《病毒性肝炎防治方案》标准［5］。90例慢性HBV感染者包括：30例HBeAg阳性CHB患者，30例HBeAg阴性CHB患者，30例慢性HBV携带者。CHB患者临床分型均为慢性中度，病程3-5年。所有患者均排除甲肝病毒、丙肝病毒、丁肝病毒、戊肝病毒、柯萨奇病毒等感染和药物、酒精等其他原因造成的肝脏损害。健康对照者30例，均来自西安市健康献血员。所有入组成员血清HBV DNA定量已在本院生化室检测。两组临床资料见表1。表1 慢性HBV感染者及对照组的临床资料（略）
1.2 标本采集与处理
无菌采集未抗凝静脉血2 mL及肝素抗凝静脉血10 mL。未抗凝静脉血-4 ℃离心后立即分离血清，-20 ℃冻存；肝素抗凝静脉血常规密度梯度法分离淋巴细胞后，洗涤细胞5次，以尽可能去除残留的血浆HBV DNA，分别收集第5次洗液(500 μL)和细胞。将细胞分两份，一份-70 ℃保存，用于检测外周血单个核细胞(PBMCs)中乙肝病毒核酸；另一份按1×107个细胞/mL加入1 mL TRIzol Reagent(美国invitrogen公司)，-70 ℃冻存，用于提总RNA。同时收集健康对照组未抗凝及抗凝血作为对照。
1.3 巢式PCR检测PBMCs中的HBV DNA
引物设计在HBV的S基因保守序列，外侧上游引物序列：5′-CATCTTCTTGTTGGTTCTTCTG-3′，下游引物序列：5′-TTAGGGTTTAAATGTATACCC-3′；内侧上游引物序列：5′-TCTATGTTTCCCTCTTGTTGC-3′，下游引物序列：5′-TACCACATCATCCATATAACTG-3′。PCR体系与反应条件：总体积25 μL，包括2.5 μL 10×缓冲液(Buffer 含20 mmol/L Mg2+)，1 μL 100 μmol/L dNTPs，外侧引物各1 μL(终浓度为0.2 μmol/L)，待测模板5 μL，Taq DNA 聚合酶0.2 μL(1 u)，纯水补足至25 μL。次轮PCR体系：取首轮PCR产物1 μL作为待测模板，余与首轮PCR体系相同。PCR反应条件：预变性94 ℃ 300 s、94 ℃ 60 s、58 ℃ 50 s、72 ℃ 60 s，30个循环，72 ℃延伸10 min。扩增产物长度分别为416 bp、206 bp。每次实验均设阳性、阴性及空白对照。阳性对照为已知CHB患者的血清，阴性对照为正常人PBMCs中DNA，空白对照为不加模板的PCR反应体系。PCR产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳分析。
1.4 PBMCs中总RNA的提取
常温解冻TRIzol Reagent保存的PBMCs，按TRIzol试剂说明书提取总RNA。用比色法(紫外线下吸收峰值)测定RNA浓度A260/A280比值，比值在1.8-2.0者用于后续实验。
1.5 cDNA合成及实时定量RT-PCR
用Re-vertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(立陶宛Fermentas公司)将上述方法提取的总RNA 2 μg分别逆转录为cDNA。IFN-γ及内对照β-actin扩增引物均由大连TaKaRa公司设计和合成。IFN-γ上游引物：5′-GCAGCCAACCTAAGCAAG-3′(nt893-911)，下游引物：5′-TCACCTGACACATTCAAGTTC-3′(nt 1 042-1 063)。内对照β-actin 上游引物：5′-GAACGGTGAAGGTGACAGCAG-3(nt1 351-1 372)，下游引物：5′-GTGGACTTGGGAGAGGACTGG-3′(nt1 529-1 550)。按SYBR Premix EX Taq(perfect real time)试剂盒(大连TaKaRa公司)说明书操作，用荧光染料嵌合法(SYBR Green Ⅰ)同时检测IFN-γ和β-actin的表达，以IFN-γ/β-actin比值反映IFN-γ mRNA的表达水平。反应在MJ Research DNA Engine OPTICONTM实时荧光PCR仪上进行。每份样本均复设3孔。
1.6 血清IFN-γ水平检测
采用Human IFN-γ ELISA Kit(美国Bender公司)检测血清IFN-γ水平，试剂盒灵敏度为0.06 pg/mL。依标准品D(λ)值作标准曲线，再计算待测样品中细胞因子含量，每份样本均设2复孔。每次均设阳性、空白对照。
1.7 统计学处理
计量资料采用(±s)表示，组间
比较采用t检验，两率的比较用χ2检验。所有统计均通过SPSS 13.0软件进行。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 慢性HBV感染者PBMCs中IFN-γ mRNA的表达
慢性HBV感染者PBMCs中IFN-γ mRNA表达水平明显低于健康对照组(P<0.01)；慢性HBV携带者PBMCs中IFN-γ mRNA的表达显著低于HBeAg阳性组和HBeAg阴性组(P<0.05，P<0.01)；HBeAg阳性组IFN-γ mRNA的表达明显低于HBeAg阴性组(P<0.01)。PBMCs中IFN-γ mRNA表达与血清HBV DNA水平呈负相关(r=-0.827， P<0.01)。不同组间结果见表2。
2.2 慢性HBV感染者血清中IFN-γ水平
慢性HBV感染者血清IFN-γ水平显著低于健康对照组(P<0.05)；慢性HBV携带者血清IFN-γ水平显著低于HBeAg阳性组和HBeAg阴性组(P<0.05，P<0.01)；HBeAg阳性组血清IFN-γ水平明显低于HBeAg阴性组(P<0.01)。PBMCs中IFN-γ mRNA表达与血清IFN-γ分泌水平呈正相关(r=0.898， P<0.01)；血清IFN-γ分泌水平与血清HBV DNA水平呈负相关(r=-0.822， P<0.01)。不同组间结果见表2。表2 慢性HBV感染者IFN-γ表达和分泌水平（略）
2.3 慢性HBV感染者PBMCs中HBV DNA的检测结果
慢性HBV感染者PBMCs中HBV DNA总阳性检出率为68.88%；慢性HBV携带者(83.33%)、HBeAg阳性组(80.00%)PBMCs中HBV DNA阳性检出率明显高于HBeAg阴性组(43.33%)(P均<0.01)，但慢性HBV携带者和HBeAg阳性组之间阳性检出率无明显差异(P>0.05)。HBV DNA阳性组和HBV DNA阴性组IFN-γ mRNA表达分别为0.546±0.515、0.986±1.272，其差异有统计学意义(P<0.01)；HBV DNA阳性组和HBV DNA阴性组IFN-γ分泌水平分别为(2.982±2.434)pg/mL、(5.768±4.365)pg/mL，其差异有统计学意义(P<0.01)。HBV DNA 阳性组血清HBV DNA 载量高于HBV DNA阴性组(P<0.01)。PCR扩增后PBMCs中HBV DNA电泳结果见图1。
3 讨 论
乙型肝炎慢性化会导致严重不良后果，而其慢性化主要与免疫功能紊乱有关。IFN-γ不仅可直接抗病毒，而且具有免疫调节功能，可增加细胞表面主要组织相容性抗原复合物Ⅰ(MHC-Ⅰ)和主要组织相容性抗原复合物Ⅱ(MHC-Ⅱ)的表达，调节巨噬细胞Fc受体、白介素2受体(IL-2R)、肿瘤坏死因子α受体(TNF-αR)的表达；激活巨噬细胞抗原处理功能，聚集特异性细胞毒性T细胞(CTL)的应答，增强NK细胞活性；下调Th3细胞产量等［6-7］。此外，越来越多证据表明Th1细胞通过IFN-γ非溶细胞机制在抑制病毒复制中起着越来越重要的作用［8］。这些功能中任何一个方面的下降都将导致HBV感染的慢性化。
已有的研究表明，急性自限性肝炎产生的IFN-γ显著高于健康对照及慢性肝炎［9］；而慢性HBV感染者外周血单个核细胞(PBMCs)不论用特异性抗原(HBeAg、HBcAg、HBsAg)还是非特异抗原(PHA)刺激，IFN-γ表达和分泌水平均较健康对照明显减低［9-11］。亦有研究发现慢性HBV感染者PBMCs产生IFN-γ水平高于健康对照，但低于急性肝炎者［12］，并且临床分型之间IFN-γ水平有差异，但无统计学意义。以上检测结果的差异与未考虑病情轻重及病程长短对检测结果影响有关［1-4］。
我们的实验结果显示，慢性HBV感染者IFN-γ表达水平降低，以炎症反应轻的慢性HBV携带者最低，HBeAg阳性组次之，转氨酶水平相对较高的HBeAg阴性组最高，表明在排除病程及病情的影响因素后，慢性HBV感染者存在着IFN-γ表达的异常，且IFN-γ水平的增高伴随着炎性反应的加重，提示IFN-γ水平对不同疾病状态及预后有较好指导意义。而IFN-γ表达和分泌水平下降将导致Th1细胞分化减少，对Th3细胞下调减弱，Th1/Th3细胞比例失调，导致Th3细胞占优而抑制细胞免疫；单核细胞分泌IL-12减少，减弱Th1细胞应答。可能正是这种不充分的细胞免疫应答不能完全清除病毒而引起肝脏持续性损伤导致慢性化形成。
我们进一步研究了影响IFN-γ表达的因素，不同组之间IFN-γ的表达以及IFN-γ表达与血清HBV DNA载量之间的关系均表明HBV感染可抑制IFN-γ水平，且HBV DNA负荷越高，对IFN-γ抑制越明显。Schlaak等［13］研究亦发现血清中高HBV DNA载量可抑制IL-12对HBV抗原诱导的特异性免疫应答的促进作用，而IL-12抗病毒效应主要是诱导Th细胞产生IFN-γ。慢性HBV感染者低IFN-γ表达可能是乙肝病毒免疫逃逸、机体产生免疫耐受状态导致慢性化的重要原因。目前仍无有效办法打破机体免疫耐受状态，免疫刺激治疗疗效不一，彻底清除HBV难度较大。而高病毒载量对IFN-γ抑制作用为临床治疗慢性HBV感染提供了另一种思路，即先用核苷类似物降低HBV DNA载量，减轻对IFN-γ抑制作用，再用免疫刺激治疗，目前已应用于临床，疗效正在观察中。
我们从mRNA和蛋白质水平证实机体感染HBV后IFN-γ的表达和分泌异常，又从多个角度表明高载量HBV可抑制IFN-γ表达，但其分子机制尚不明确。有资料显示IFN-γ表达异常可能与HBV感染致IFN-γ信号转导途径受阻、转录调节障碍(包括转录调节因子、染色体结构重塑、启动子甲基化)有关［14-15］。探讨HBV感染时IFN-γ基因表达异常的分子机制将有助于我们更进一步理解乙型肝炎的发病机理。目前有关这方面研究甚少。
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