作者：陆寒，解志刚，王明丽，施明，胡美茹，于鸣，马远方，沈倍奋，郭宁
【摘要】 目的 构建一种新型三价抗ErbB2、抗CD16 BsAb。方法 构建重组载体pET22b(+)/BsAb；转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组蛋白的表达，通过包涵体复性纯化蛋白。应用悬浮培养系统扩增稳定表达抗人CD16 scFv-Fc融合蛋白的CHO细胞株(CG5细胞)和稳定表达抗人ErbB2 scFv-Fc融合蛋白的CHO细胞株(HG2细胞)，通过rProtein A Sepharose Fast Flow亲和层析柱纯化融合蛋白，应用流式细胞术分析BsAb的结合能力。结果 该BsAb可在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式高效表达，通过对重组蛋白的复性可获得高纯度的蛋白；复性后的BsAb具有与其亲本抗体相似性的结合靶抗原的能力。结论 新型三价抗ErbB2、抗CD16 BsAb能与高表达ErbB2的乳腺癌细胞系SKBR3细胞高亲和力结合和表达CD16的人外周血单个核细胞低亲和力结合。
【关键词】 双特异性抗体 ErbB2 CD16 肿瘤免疫治疗
ABSTRACT: Objective To construct a novel trivalent anti-ErbB2/CD16 bispecific antibody. Methods The recombinant plasmid pET22b(+)/BsAb was constructed. The recombinant protein was expressed in E.coli BL21 strain (DE3) and purified by refolding. By using Spinner System， CG5 cells， CHO cells stably expressing anti-CD16 scFv-Fc fusion protein and HG2 cells， CHO cells stably expressing anti-ErbB2 scFv-Fc fusion protein were expanded. The fusion proteins were purified over rProtein A Sepharose Fast Flow Column. The binding activity of the BsAb was analyzed by flow cytometry. Results The BsAb was efficiently expressed in E.coli BL21 strain (DE3) as inclusion bodies. High purity of recombinant protein could be obtained by refolding. The BsAb possessed the capability of binding to the target antigens as its parental antibodies. Conclusion The novel BsAb was able to bind human breast cancer cell line SK-BR-3 highly expressing ErbB2 and human peripheral blood mononuclear cells expressing CD16.
KEY WORDS: bispecific antibody; ErbB2; CD16; tumor immunotherapy
治疗性抗体主要通过介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity， ADCC)和补体依赖的细胞毒性(complement dependent cytotoxicity， CDC)等机制实现对肿瘤细胞的杀伤［1-2］。目前已有多种抗体被批准用于肿瘤的临床治疗。然而，抗体的天然效应功能很弱，生理条件下血清中存在的高浓度IgG可与治疗性抗体竞争结合效应细胞表面的Fc受体(Fc receptor， FcR)，从而影响了抗体的功能。因此，提高抗体的效应功能一直是抗体工程领域的重要发展方向［1-3］。
双特异性抗体(bispecific antibody， BsAb)是一类具有双亲嗜性的组合抗体，具有结合两种不同特异性抗原的功能。BsAb可同时与肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原和效应细胞表面的触发分子结合，从而直接介导效应细胞对肿瘤细胞的杀伤。体内外实验研究结果表明，BsAb可介导更强的抗肿瘤活性。然而，对10余种不同的BsAb的临床实验研究发现，BsAb虽然表现出一定的疗效，但明显的毒副反应影响了BsAb的治疗剂量［4-5］。
抗体治疗一般通过静脉给药，治疗性抗体在循环中首先与效应细胞遭遇而结合于效应细胞。在抗体尚未到达靶部位之前，即可能引发效应细胞广泛活化，导致细胞因子释放综合征［6-8］。另一方面，抗体很大程度上可能是由效应细胞携至肿瘤局部，而并非在肿瘤靶部位招募效应细胞。这些问题给抗体研发工作者带来了新的思考。
为了使抗体能快速到达肿瘤局部，提高局部效应细胞的密度，进而产生对肿瘤细胞的有效杀伤，减少毒副作用，抗体研究者曾提出，一个理想的BsAb应当具有能高亲和力结合肿瘤细胞及单价触发效应细胞的特性。我们在前期工作中构建了一个新型的三价BsAb。这个BsAb能够与肿瘤靶抗原以双价的单链抗体(single chain Fv， scFv)形式结合，而与表达CD16的效应细胞则以单价的Fab形式结合。由于该BsAb缺乏抗体Fc区，纯化效率较低，从而影响了体内外活性研究的开展。为了克服BsAb的纯化难题，我们对该抗体的表达及纯化方案做了进一步的探索，获得了BsAb在原核细胞中的高效表达，并纯化得到可供体内外实验用的足量蛋白。通过实验证明，BsAb保留了良好的结合活性。
1 材料与方法
1.1 菌株、质粒和细胞
IgG1重链第一恒定区(constant region of heavy chain， CH1)和κ链恒定区(constant region of light chain， CL)基因由军事医学科学院生物工程研究所童贻刚博士提供(GenBank AF027159， X95747)；鼠抗人ErbB2 scFv cDNA由美国犹他大学药学院Yu Lei博士提供；大肠杆菌菌株BL21(DE3)、原核表达载体pET22b(+)、稳定表达抗人CD16 scFv-Fc融合蛋白的CHO细胞株(CG5细胞)、稳定表达抗人ErbB2 scFv-Fc融合蛋白的CHO细胞株(HG2细胞)、人乳腺癌细胞系SKBR3细胞(ATCC No. HTB-30)为本室保存。
1.2 试剂和培养基
限制性内切酶为Biolab公司产品；AMV反转录试剂盒、Taq DNA聚合酶、Wizard Purifection 质粒提取试剂盒为Promega公司产品；DNA片段回收试剂盒为北京鼎国生物技术公司产品；羊抗人IgG、辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG及人IgG购自北京中山生物技术公司；G418、TRIZOL总RNA抽提试剂、T4 DNA 连接酶购自GIBCO BRL公司；IPTG为Sigma公司产品；人淋巴细胞分离液为TBD公司产品；rProtein A Sepharose Fast Flow亲和层析柱购于Amersham Bioscience公司；Spinner System 为IBS Integra Biosciences公司产品；无血清培养基HyQSFM4CHO购自HyClone公司；DMEM培养基为Sigma公司产品；RPMI 1640(无酚红)培养基为Hyclone公司产品。
1.3 三价BsAb表达载体的构建
从分泌抗CD16单克隆抗体的B88-9细胞中提取总RNA，以5′-RACE策略克隆可变区基因［9］。根据抗CD16VL、VH、抗ErbB2 scFv、核糖体结合位点(RBS)、细菌信号肽(pelB)、CH1和CL序列及pET22b(+)载体中的多克隆位点设计引物(表1)。用引物P1和P2 PCR扩增抗CD16 VL片段；RBS和 pelB通过引物P7、P8、P9融合于抗CD16 VH的5′端；以含人IgG1重链第一恒定区(CH1)和κ链恒定区(CL)基因的质粒为模板，以引物P3和P4扩增CL片段，引物P11和P12扩增CH1片段。以质粒pcDNA3/ErbB2 scFv为模板，以引物P5和P6、P13和P14分别扩增scFv片段，获两条扩增片段，其两侧分别携EcoRⅠ/HindⅢ及NotⅠ/XhoⅠ酶切位点。VL和CL、VH和CH1融合片段采用重叠延伸PCR法进行连接。用DNA片段回收试剂盒纯化回收PCR产物，NcoⅠ、EcoRⅠ双酶切VL-CL片段，EcoRⅠ、HindⅢ双酶切scFv 片段，HindⅢ、NotⅠ双酶切RBS-PelB-VH-CH1片段，NotⅠ、XhoⅠ双酶切scFv片段，各片段依次插入pET22b(+)载体中的相应多克隆位点，重组载体命名为pET22b(+)/BsAb。重组载体经酶切及测序鉴定。表1 扩增和构建BsAb所用引物（略）
1.4 三价BsAb表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达
将重组载体pET22b(+)/BsAb转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单菌落接种于含100 mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，37 ℃震荡培养至A600约为0.4，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside， IPTG)至终浓度分别为0.2 mmol/L和0.5 mmol/L，室温下130 r/min震荡培养3 h。每个样品取1 mL，10 000 g离心15 min收获细菌菌体，重悬菌体于200 μL PBS中，反复冻融3次后，超声破菌(脉冲60%，45 s/次×10)，4 ℃下10 000 r/min离心15 min，收集上清，通过SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色分析。
1.5 三价BsAb的纯化
分别用TE+0.5%(体积分数)Triton-100 20 mL、TE 20 mL、TE+8 mol/L尿素10 mL重悬沉淀，超声破菌4次，沉淀完全溶解于8 mol/L尿素中，经TGE［50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L EDTA， 50 mmol/L NaCl，5%(体积分数)甘油，0.05 mol/L氧化型谷胱甘肽，0.5 mol/L还原型谷胱甘肽］透析复性，通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色对透析后的蛋白鉴定及定量。
1.6 抗人ErbB2 scFv-Fc及抗人CD16 scFv-Fc融合蛋白的表达
稳定表达抗人ErbB2 scFv-Fc融合蛋白的HG2细胞及稳定表达抗人CD16 scFv-Fc融合蛋白的CG5细胞培养于含200 mg/L G418的无血清HYQ SFM4CHO(Hyclone)培养基中。待培养物体积达40 mL时，采用悬浮培养系统(Spinner System)扩增细胞。培养细胞经125 mL及250 mL悬浮培养体系依次扩增，至培养体积达200 mL时，停止添加培养液。在30 ℃下继续培养5-7 d。离心取培养细胞上清，保存于4 ℃。
1.7 抗人ErbB2 scFv-Fc及抗人CD16 scFv-Fc融合蛋白的纯化
应用rProtein A Sepharose Fast Flow亲和层析柱纯化融合蛋白。将细胞悬液在4 ℃下3 000 r/min离心10 min，取上清。重复离心后，收取上清。用中和缓冲液(1 mol/L Tris，pH 8.0)将上清调至pH 8.0；用10倍柱体积的起始缓冲液(0.15 mol/L NaCl， 0.1 mol/L Tris， pH 7.5)平衡rProtein A Sepharose Fast Flow亲和层析柱，平衡速度1 mL/min；将调整pH值后的上清以1 mL/min的速度上样，并接取上样流出液。用起始缓冲液洗柱以去除非特异结合抗体；用洗脱液(0.1 mol/L甘氨酸)洗脱结合的融合蛋白。洗脱蛋白通过SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色分析。
1.8 夹心ELISA法检测融合蛋白的表达水平
羊抗人IgG(2 mg/L)包被96孔板，置于湿盒内4 ℃过夜。甩去包被液，用50 g/L牛血清白蛋白(bovine serum albumin， BSA)200 μL/孔4 ℃封闭1 h。甩去封闭液，加入系列稀释的纯化蛋白，37 ℃温育1 h。洗涤缓冲液(phosphate buffered saline tween 20， PBST)洗板5次后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG(1∶5 000稀释)，37 ℃温育1 h。PBST洗板5次后，邻苯二胺(o-phenylenediamine， OPD)显色，2 mol/L h3SO4终止反应，测定A492。
1.9 异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate， FITC)标记抗体
将纯化透析后的三种抗体(三价BsAb、抗人ErbB2 scFv-Fc融合蛋白、抗人CD16 scFv-Fc融合蛋白)经紫外分光光度仪测定蛋白含量，用0.5 mol/L Na2CO3调抗体pH值至9.0；称取FITC，用二甲基甲酰胺溶解至浓度为10 g/L，按照FITC与抗体的克分子比为5∶1将FITC加入抗体。室温下用磁力搅拌器避光搅拌反应1.5-2 h。4 ℃下磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline， PBS)透析过夜，以除去未结合的FITC分子。次日取出透析后抗体，紫外分光光度仪检测A280和A495，计算标记效率。
1.10 BsAb结合活性的检测
用2.5 g/L胰蛋白酶消化SKBR3细胞，6 000 r/min离心1 min收集细胞，洗涤缓冲液(PBS， 20 g/L BSA， 1 g/L NaN3， PBA)离心洗涤1次。将细胞平均分至3管，每管5×105个细胞，分别与FITC标记的BsAb、抗人ErbB2 scFv-Fc及作为阴性对照的PBS混合，抗体的终浓度均为7.5 mg/L。冰浴震荡孵育30 min，冷PBA离心洗涤2-3次，用10 g/L多聚甲醛/PBS重悬细胞，用流式细胞仪(Becton Dickinson公司)分析抗体与SKBR3细胞表面ErbB2分子的结合。
取健康人外周血，按照淋巴细胞分离液操作说明分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells， PBMC)，用冷PBA离心洗涤1次，每个样品取9×105个细胞分别与FITC标记的BsAb、抗人CD16 scFv-Fc及作为阴性对照的PBS 冰浴振荡孵育30 min(抗体终浓度均为7.5 mg/L)，冷PBA离心洗涤2-3次。用10 g/L多聚甲醛/PBS重悬细胞后，应用流式细胞仪分析抗体与CD16分子的结合。
2 结 果
2.1 三价BsAb的构建
三价BsAb是以人IgG重链第一恒定区(CH1)和κ链恒定区(CL)作为异二聚化结构域，在CH1的N端连接抗CD16抗体的重链可变区(VHCD16)，在CH1的C端连接抗ErbB2 scFv(scFvErbB2)，形成VHCD16-CH1-scFvErbB2嵌合链；在CL的N端连接CD16抗体的轻链可变区(VLCD16)，在CL的C端连接scFvErbB2，形成VL CD16-CL-scFvErbB2嵌合链。两条多肽链通过CH1和CL异二聚化则可装配成三价BsAb。应用设计的引物PCR扩增各片段，结果见图1-图4。PCR产物经酶切后依次插入pET22b(+)载体中的相应多克隆位点，得到重组载体pET22b(+)/BsAb。构建过程如图5。重组载体经酶切及测序鉴定正确。
2.2 三价BsAb表达和纯化
将重组载体pET22b(+)/BsAb转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达，SDS-PAGE结果显示，在分子量约55 ku处有新增蛋白条带，但3次超声破菌透析后上清目的蛋白的表达量均很低，而沉淀中目的蛋白量较大，故选择对包涵体进行变性和复性处理。经8 mol/L尿素变性后，沉淀完全溶于8 mol/L尿素内，通过逐渐降低透析液内尿素的浓度，使包涵体缓慢复性，获得浓度为1 g/L的目的蛋白，结果如图6。在实验中我们发现，缓慢降低透析液内尿素含量所获得的蛋白活性较好。
2.3 抗人ErbB2和抗人CD-16 scFv-Fc融合蛋白的表达与纯化
我们在前期研究中构建了含抗ErbB2 scFv-Fc及抗CD16 scFv-Fc的真核表达载体。为比较三价BsAb与其不同特异性的亲本抗体的结合活性，我们在构建三价BsAb同时，还表达纯化了抗人ErbB2 scFv-Fc融合蛋白和抗人CD16 scFv-Fc融合蛋白。抗人ErbB2 scFv-Fc及抗人CD16 scFv-Fc是鼠源抗ErbB2及抗CD16 单链抗体与人IgG1 Fc段的融合蛋白，两者均为单一多肽链，通过Fc段可组装形成同源二聚体［10］。用表达载体转染CHO细胞，经G418筛选分别获得稳定表达抗人ErbB2 scFv-Fc融合蛋白的HG2细胞及稳定表达抗人CD16 scFv-Fc融合蛋白的CG5细胞，并通过逐渐降低培养基中血清浓度实现了工程细胞的悬浮驯化。应用Spinner system扩增细胞，通过夹心ELISA法实时监测了250 mL悬浮培养系统中工程细胞在培养2、4、6、7 d时培养上清中融合蛋白的含量(图7、图8)。图7显示，在一定时间内随培养时间的延长，培养上清中融合蛋白的含量也逐步增高，抗ErbB2 sc-Fv的表达水平可达250 μg/L。图8显示，抗CD16 sc-Fv的表达水平可达150 μg/L。但进一步延长培养时间，工程细胞的表达水平不再升高，细胞活力进一步降低。因此，我们收集培养第7天的上清进行纯化。
应用rProtein A Sepharose Fast Flow亲和层析柱纯化获得融合蛋白。取5 μL样品通过SDS-PAGE分析，可见两种 scFv-Fc融合蛋白的分子量约为50 ku，纯化蛋白浓度约为2 g/L(图9)。
2.4 抗体结合活性的鉴定
我们用FITC对三价BsAb、抗ErbB2 scFv-Fc以及抗CD16 scFv-Fc融合蛋白进行了标记。通过以下公式计算标记效率(F/P值)。三价BsAb、抗ErbB2 scFv-Fc及抗CD16 scFv-Fc融合蛋白的F/P值分别为4.81、3.54及3.2，均在理想的F/P值(3-5)之间。
应用流式细胞分析，我们比较了三价BsAb及抗ErbB2 scFv-Fc融合蛋白与SKBR3细胞表面ErbB2分子结合的能力。我们先前的研究已证实抗人ErbB2 scFv-Fc融合蛋白为同源二聚体，异二聚化的三价BsAb具有2个ErbB2结合位点。我们的结果显示，两者结合活性无明显差异(图10)。
CD16是NK细胞的表面标志。由于所设计的三价BsAb以单价的Fab形式与CD16结合，其结合抗原的能力决定其是否能触发效应功能。为了检测三价BsAb能否与PBMC上的CD16结合，我们将FITC标记的三价BsAb与PBMC孵育，同时将FITC标记的抗人CD16 scFv-Fc融合蛋白亦与PBMC反应，检测两者与CD16结合能力的差异。结果显示，三价BsAb能与CD16结合，但与其亲本抗CD16 scFv-Fc相比，结合能力稍弱(图11)。
3 讨论
研究证实，靶向肿瘤相关抗原的特异性抗体与触发效应细胞(NK细胞、LAK 细胞、CTL 细胞等)的抗体组成的BsAb能有效地将效应细胞携至肿瘤细胞周围，激活效应细胞发挥抗肿瘤作用，且这种靶向杀伤作用不受主要组织相容性复合体(major histocompability complex， MHC)的限制。
ErbB2是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，属于I型生长因子受体家族成员。ErbB2在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、肺癌等多种上皮细胞来源的恶性肿瘤中过表达，而在正常组织中表达水平很低。因此，ErbB2是肿瘤免疫治疗的理想靶分子［12］。CD16为IgG Fc受体Ⅲ(FcγRⅢ)，主要表达于NK细胞、巨噬细胞、活化的单核细胞和中性粒细胞表面。IgG的Fc片段及抗CD16抗体与CD16结合均可触发ADCC作用。因此，CD16是导向免疫治疗的良好候选分子［13］。
在已开展的BsAb临床实验中发现，BsAb可导致循环系统白细胞表面FcR广泛交联，导致大量细胞因子释放而诱发全身毒性反应，如：发热、恶心、呕吐、白细胞减少、血小板减少、单核细胞减少、淋巴细胞减少等症状，限制了BsAb的临床应用。为优化BsAb的结构以降低其毒副作用，我们在前期工作中构建了一个新型BsAb。该BsAb的主要特点在于其与表达CD16的效应细胞以单价结合，以降低在循环中与效应细胞结合的水平，使之能直接、快速到达肿瘤部位，在局部招募效应细胞、产生对肿瘤细胞的特异性杀伤，从而避免BsAb在引发循环中效应细胞表面FcR广泛交联而导致毒副作用。由于前期构建的BsAb缺乏抗体Fc区，导致该抗体纯化困难，产量较低，影响了体内外实验的开展。为方便BsAb的纯化及提高产量，本实验曾试图通过构建His标签蛋白及镍离子亲和层析纯化可溶性重组蛋白，但由于可溶部分含量低，我们随后放弃了该方案，决定通过包涵体复性获得BsAb。在纯化过程中，我们采用8 mol/L尿素变性，然后通过逐渐降低透析液中尿素的含量对其进行缓慢复性。结果证明，复性后此三价BsAb保留了很好的与ErbB2和CD16分子结合的活性。这个三价BsAb的成功表达、纯化为后续体内外抗肿瘤功能的研究打下了良好的基础。
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