【摘要】 大骨节病是一种地方性、畸形性骨关节病，至今原因未明，目前以我国西部地区最重，尚无有效治疗措施。本文依据国内外有关研究，总结分析了大骨节病三种病因假说的研究进展及其尚待解决的问题，结合作者及其研究团队近年来的研究进展，提出大骨节病除经典的软骨细胞坏死外还表现有软骨细胞过度凋亡和“去分化”，大骨节病软骨细胞差异表达基因、血清蛋白表达谱及短串联重复序列多态性不同于病区内外正常人与骨关节病。确定大骨节病软骨细胞坏死发生的基因与蛋白标志物，以及何种环境因素如何与大骨节病易感基因相互作用而选择性的损伤深层软骨细胞及其干预措施，是未来大骨节病病因发病机制研究的重要目标。
【关键词】 大骨节病 病因 发病机制 基因 蛋白组学
ABSTRACT: Kashin-Beck disease (KBD) is an endemic and deforming osteochondropathy and its etiology remains unclear up to now. The prevalence of the disease is the severest in the western China and the effective methods for prevention and cure still need further study. This article summarized the progression and problems to be investigated for three main hypotheses of KBD by reviewing literature published at home and abroad. Integrating with his own research work and his team members， the author suggested that excessive apoptosis and dedifferentiation of chondrocytes besides classic chondrocytic necrosis in KBD growth plate and articular cartilage， differences of gene expression profiles in cartilage and peripheral blood mononuclear cells， proteomic markers and short tandem repeat polymorphism in KBD patients were significantly different from those of the healthy subjects from both KBD-areas and non KBD-areas， and those of osteoarthritis patients. The important objectives in the future are to understand ① the gene and proteomic markers for chondrocytic necrosis in KBD， ② environmental factors that cause the damage to KBD chondrocytes， ③ the way it selectively impairs chondrocytes in the deep zone of growth and joint cartilage by interacting with susceptible gene related to KBD， and ④ effective intervention methods.
KEY WORDS: Kashin-Beck disease(KBD); etiology; pathogenesis; gene; proteomic marker
大骨节病的发生至少可追溯到16世纪，其中病因与发病机制的研究始于N.I.Kashin(1859-1868年)和E.V.Beck(1906-1908年)。从最早苏联、日本学者提出居民膳食和饮水中元素比例失调、水中有机物中毒和食用了镰刀菌污染的谷物致病因素到目前我国深入到分子生物学水平的研究大骨节病病因及发病机制，国内外学者对大骨节病病因及发病机制进行了长期艰苦研究，做出了卓越的贡献。特别是20世纪50年代以来，我国学者不但发展和验证了既往的病因学假说，还提出了环境硒缺乏和粮食T-2毒素污染中毒等病因学的新认识。
长期以来认为大骨节病的深层软骨细胞坏死是环境有害因素所致，国内外做了大量病因调查研究工作，先后提出大骨节病可疑致病因素有50余种［1-5］，主要涉及放射性物质中毒说(I.A.Bagashevd等，1911-1925年)、维生素缺乏说(V.G.Shchipachev， K.K.Platonov等，1925-1936年)、传染中毒说(V.Barykin，S.Klyukhin，1926年)、内分泌失调说(V.G. Shchipachev， 1927-1936年)、水中铅过量说(N.L.Sakovich等，1927-1935年)、铁慢性摄取过剩说(M.Aiiso， K. Hiyeda等，1932-1937年)、钙缺乏说(N.S.Dombrovskaya等，1929-1959年)，真菌中毒理论(F.P.Sergievsky等，1932-1937年)、生物地理化学学说(A.P.Vinogradov等，1939-1963年)、水中有机物污染中毒说(M.I.Dobrovolsky， N.L.Sakovich，1926-1933年)、自由基机制(彭安等，1990年)、环境低温低硒生态效应(李芳生，1990年)、病毒感染(毕华银等，1995年)以及低硒条件下的复合病因等。这些因素中既有单一的环境因素也有多种因素的复合，其中一些是大骨节病发生的主要危险因素，一些可能是发病相关的辅助因素，另一些则已随着大骨节病病因学实践认识的深入发展而相继被淘汰。归纳目前国内外广泛和深入研究的病因假说主要集中在生物地球化学学说、粮食镰刀菌毒素中毒学说和饮水有机物中毒学说。随着分子生物学技术的迅速发展，近年来大骨节病病因发病机制研究已涉及易感基因及分子生物学机制等问题。因而，进一步从环境因素、人群、个体、组织、细胞、基因多层次水平去认识大骨节病的病因与发病机制，必将大大提高本病的防治理论和技术水平。
1 生物地球化学说
生物地球化学说(biogeochemical hypothesis)认为，大骨节病的发生与特定的地理生态环境有关。即，病区环境某些化学元素或化合物过多、缺乏或比例失调，影响体内矿物质的正常代谢而引起大骨节病。1939-1949年苏联学者A.P.Vinogradov根据地方病病区环境土壤、水和作物中多种微量元素不平衡等因素首先提出生物地球化学学说［1］。1949-1973年V.V.Kovalsky等认为大骨节病病区水、土和居民膳食中锶、钡多及钙、磷、钾、钠少，锶钙比例失调；1967-1968年N.I.Muchkin等提出钙、碘、镍、铜、铁、硫、铍、氟和锶、钡多，特别以病区冻土层为显著。后又提出病区水土和主副食中含磷、锰过多而致病。病区环境可溶性无机元素离子显著流失，病区水、土、粮中硫、镁少，而锶、钡、铁、锌、硅多，且元素之间比例失调，出现单一元素的缺乏或过多以及元素离子之间的比例失调，诸如病区水粮中Ca2+/SO2-4、Sr2+/SO2-4、Ba2+/SO2-4、硅/SO2-4、钙/硅与大骨节病病情有明显相关。Sr2+/SO2-4以及Sr2++Ba2+/SO2-4病区在1%以上，而非病区在1%以下［6］。大骨节病患者的血和骨中锶含量显著增高，而头发中Ca/Sr、Mg/Sr均低于健康人；病区水质中(Sr2++Ba2+/SO2-4+Mg)/总离子量×1 000的比值与大骨节病发病有一定的规律［2］。病区的水、土、粮中硫含量偏低，采用放射性35S示踪方法证实大骨节病不是外源性缺硫引起，而显示有硫代谢障碍［6］。检测大骨节病患者手、足、腕、踝、肩和膝关节及发中的硅含量均显著地高于正常对照者；病区的饮用水在微沸条件下可检出主要含硅酸盐的沉淀物，其硅含量与患病率呈正相关；用高硅饲料喂养幼犬出现类似人类大骨节病较相似的病理改变［2］。硫酸铊致鸡胚软骨细胞营养不良性坏死，与大骨节病的病变极其相似［7］。纵观大骨节病水、土、粮涉及缺乏或过多的元素有硒、铁、锶、钡、钛、铅、铜、镁、铝、钒、硅、铊等，其中以硒缺乏说占主导地位，其他元素与大骨节病的分布与发生无一致相关性［8］，且未能在大骨节病患者或实验动物体内找到特异性损害软骨细胞的确切证据。
20世纪70年代，我国学者发现环境低硒与大骨节病关系密切［9-10］，并逐渐发展为硒缺乏或低硒学说(selenium deficiency)，其主要论据有：①我国大骨节病区内、外环境硒含量低，经由病区食物链导致人群呈低硒营养状态。大骨节病的病区分布与低硒土壤地带大体上一致，大部分病区的土壤总硒含量在0.15 mg/kg以下，粮食硒含量多低于0.020 mg/kg，而且病区的土壤、小麦、玉米中的硒含量明显低于非病区；②病区人群的血、尿、头发硒含量均低于非病区人群，患者体内存在以低硒为中心的一系列代谢变化，诸如全血的GSH-PX活性降低，血清GOT、GPT、LDH、HBDH、脂质过氧化物(LPO)和游离脂肪含量等活性增高。一些调查表明，病区与非病区人群的发硒界限值为200 ng/g，也有学者认为是110 ng/g；③流行病学调查显示低硒与大骨节病X线患病率呈负相关；④病区补硒后能降低儿童大骨节病的新发率，促进干骺端病变的修复，防止病情恶化。例如在病区居住的9 343例正常儿童中，补硒后大骨节病的新发率为0.45%，而在同期未补硒的2 963例病区居住的正常儿童中，新发率为1.95%，两组的发病率有非常显著性差异。又在2 197例儿童大骨节病患者中补硒组干骺端病变的修复率为64.80%，病情加重率为2.82%，未补硒组的修复率为19.88%，加重率为11.28%，补硒组干骺端病变的修复率明显高于未补硒组。
大骨节病病区除环境低硒外还伴随有碘元素的缺乏［11］。在我国的大多数低硒地区同时伴有低碘，病区环境可同时呈现缺硒与缺碘；但也有调查表明在低碘地区却不一定伴有低硒。甘肃省大骨节病病区饮水中碘含量低于5 μg/L，属低碘环境，其大骨节病病区与碘缺乏病重病区分布一致，严重缺碘所致的地方性克汀病分布与大骨节病病区高度吻合［12］。我国地方性克汀病患者90%以上分布在同时有大骨节病流行的病区，在陇南的大骨节病重病区，地方性克汀病患者占全部患者的46.7%。由于病区食用碘盐，儿童尿碘、T3、T4、TSH均在正常值范围内(一般病区儿童的T3、T4显著高于非病区，TSH则显著低于非病区)。这可能是低硒导致的TSH代偿性分泌增高引起。西藏大骨节病病区儿童中硒、碘水平的调查结果表明，49%的病区儿童患有大骨节病，46%的儿童患有甲状腺肿，1%患有克汀病；66%的儿童尿碘低于20 μg/L，大骨节病患者的尿碘含量显著地低于对照组；多因素分析结果表明：在严重低硒的大骨节病流行区，碘元素是大骨节病发病的危险因素。碘元素是合成甲状腺素所必需的物质，而甲状腺素对骨的生长发育有重要的调节作用。然而，1957年Zagrafsky等［1，5］调查则证实大骨节病病区与地方性甲状腺肿病区不相重叠；在动物实验中，低碘也不能造成类似人类大骨节病样的软骨坏死。
尽管大量研究表明低硒与大骨节病发病有关联，然而仍有许多证据不支持低硒是大骨节病的特异致病因子，低硒并非大骨节病的直接和唯一病因。这是因为：①有些地区低硒，并不发生大骨节病(如，我国的低硒地区四川南部县、新西兰、芬兰等国的低硒地区)；有些地方硒水平并不很低，却有本病发生(如，山东的益都，山西的左权、霍县，青海的班玛县［13］等)；②补硒后不能完全控制本病的新发；环境低硒状况未改变时，大骨节病的病情也可以下降；低硒与大骨节病关系的前瞻性研究未显示低硒与大骨节病发病率之间有剂量反应关系［14］；③细胞培养表明，软骨细胞生长对硒并无特殊需要；④低硒粮喂养大鼠和中国小型猪，均未引起像人类大骨节病那样的骺板和关节软骨坏死［15］，但可见软骨细胞去分化和凋亡，膝关节软骨表面有软骨纤维化发生，电镜观察可见深层软骨细胞细胞核变性和胞浆呈网状气球样；病区粮补硒并不能防止猴模型软骨坏死的发生，但能使之减轻。低硒/低碘或低硒联合低碘的实验三代大鼠也未能观察到类似人类大骨节病软骨细胞坏死的特征性变化［16］。因而，目前倾向于认为环境硒缺乏是大骨节病发病的重要环境因素之一。
2 粮食真菌毒素污染及其毒素中毒假说
粮食真菌毒素污染及其毒素中毒假说(hypothesis of cereal contamination by myco- toxin-producing fungi)认为，病区谷物被某种镰刀菌及其所产生毒素和代谢产物污染并形成耐热的毒性物质，居民因食用含有此种霉菌与毒素的食物而发生大骨节病。1932-1945年间苏联学者F.P.Sergievsky、Y.I.Rubinstein等认识到病区粮食是致病因子进入人体的主要载体，谷物在收割、脱粒、晾晒、储存过程中被真菌污染，在潮湿条件下孳生产毒是导致大骨节病的主要途径，进而又提出大骨节病是病区的小麦由于尖孢镰刀污染及其产生的毒素选择性地损害发育中软骨内化骨型骨骼的一种食物性镰刀菌中毒症(food mycotoxic enchondral osteodystrophy)［17-18］。该学说提出的主要论据有：①从原苏联和中国的病区分布来看，病区皆属大陆性气候，暑期短，霜期长，昼夜温差大，粮食收获时多在雨量较多的季节，存在着粮食真菌生长的适宜条件［5，17-18］；②大骨节病病区粮食可检出多种优势真菌，如原苏联的赤塔病区以梨孢镰刀菌(fusarlum sporotrichiella.var. Poae)为主，我国东北病区以尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)为主，陕西病区以禾谷镰刀菌(fusarlum graminearum)和串珠镰刀菌(fusarlum moniliforme)为主，甘肃病区以互隔交链孢霉(alternaria alternata)为主［18］；③在病区粮食中先后检出的较非病区浓度高的真菌毒素有丁烯酸内脂(butenolide， BUT)、交链孢霉甲基醚(alternariol methyl ether， AME)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol， DON)、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-deoxy- nivalenol， 15-DON)、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-deoxynivalenol， 3-DON)、雪腐镰刀菌烯醇(nivalenol， NIV)［18］；④体外软骨细胞培养证明BUT、DON、NIV等真菌毒素亦可引起软骨细胞去分化和凋亡，对抑制DNA的合成和细胞的分裂增殖具有明显的作用，能损伤包括对细胞膜、核膜及所有细胞器的软骨细胞膜系统，引起软骨生物化学代谢障碍［19-20］；用拟枝孢镰刀菌和梨形枝孢镰刀菌、尖孢镰刀菌的提取物饲养大鼠和小狗均可发生类似大骨节病的软骨病变，但尚未认定是大骨节病的动物模型［18］；⑤双鸭山市(1972-1980年)、吉林抚松县(1958-1965年)大骨节病区换粮防治大骨节病试验和尚志县种水田主食大米防治大骨节病的现场试验(1970-1988年)均取得了有效的预防效果［21］。
从20世纪90年代以来，我国学者杨建伯提出了T-2毒素是引起大骨节病的致病物质［22］，其主要论据有：①大骨节病病区小麦、玉米中T-2毒素的超常聚集距为2.0-1 549.4 ng/g；采用ELISA从大骨节病病区病户的面粉中检出T-2毒素，且含量高于病区市售面粉的含量；病区面粉的T-2毒素含量在100 μg/kg以下，或至少到300 μg/kg以下乃是阻断大骨节病病因的措施；②饲料中加入纯T-2毒素100 ng/(kg·d)饲养雏鸡3-5周， 可引起雏鸡类似大骨节病的病理改变，与利用镰刀菌菌粮按1/10比例掺入鸡饲料喂养的结果相似［23］；③T-2毒素对软骨细胞的增殖有明显的抑制作用，并与T-2毒素浓度呈剂量-效应关系；④T-2毒素可以引起体外培养的软骨细胞凋亡［24］。
然而粮食真菌毒素污染及其毒素中毒假说目前仍存在着一些难以解释的问题，如：①在流行病学上如何解释病区近距离灶状分布问题，用温度、湿度、粮食收割贮存条件等均难以作出令人信服的解释；在无大骨节病的其他国家，T-2毒素、BUT、DON、NIV等真菌毒素污染也广泛存在；②各病区分离出的菌种不尽相同，如有些病区分离出的优势菌种是互隔交链孢霉菌而不是镰刀菌；病区与非病区间差别的规律不强，如在大骨节病病区自产的玉米、小麦粮食中分离出了尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、禾谷镰刀菌和互隔交链孢霉菌等真菌；③在我国各地检出的优势菌及毒素不尽一致，如东北病区是尖孢镰刀菌，有一些病区是串珠镰刀菌，陕、甘两省一些病区是互隔交链孢霉菌，如陕西彬县韩家乡及榆林蟒坑村小麦优势菌为互隔链孢霉菌，未曾检出镰刀菌；④测定10例大骨节病干骺端新发患儿血清中11种镰刀菌毒素无一例阳性［25］；⑤镰刀菌毒素(如禾谷粉红色镰刀菌的TDP-1、梨孢镰刀菌毒素、T-2毒素，等)对软骨细胞并无选择性毒性作用，可引起软骨细胞以外多种组织和细胞的损伤，如国外研究表明T-2毒素引起实验动物(大鼠、小鼠、猪、猴)肝细胞腺瘤、肺腺瘤、T、B、淋巴细胞、白细胞减少及胚胎毒性和神经毒性损伤，并具有致癌性［26-27］；对体外单层培养兔关节软骨细胞有损伤，在5×10-9mol/L时，减少软骨细胞DNA合成的50%以上［28］；⑥饲料中加入纯T-2毒素100 μg/kg饲养雏鸡3-5周，不发生关节软骨的变性和坏死，胫骨上端骺软骨未见类似大骨节病的灶状或片状软骨细胞坏死［29］；⑦人群T-2毒素中毒症状体征不同于大骨节病，如浙江桐乡县部分居民误食T-2毒素污染(180×10-9-418×10-9)的霉变大米，发生急性食物中毒，发病率为58.00%，主要症状有恶心、嗜睡、呕吐、腹胀、腹痛等，表明T-2毒素急性中毒症状与大骨节病并无相似性［30］。
鉴于环境硒缺乏与粮食真菌毒素均与大骨节病有关，因此要关注二者联合作用是否可致大骨节病软骨细胞深层灶状或带状样坏死。有实验表明，低硒与真菌或镰刀菌毒素联合作用可致关节软骨深层坏死或软骨发育不良，但还不能认定是类似人类大骨节病的动物模型。低Se饲料(含Se 35 ng/kg)喂养小型猪30 d后再加入T-2毒素(1.5 mg/kg饲料)或串珠镰刀菌素(moniliforme， MON，1 mg/kg体重)喂养67 d，发现多个骨的关节软骨深层出现带状坏死，但骺生长板软骨却未出现［31］，提示实验动物在硒营养缺乏基础上联合T-2毒素或MON中毒，可引起关节软骨出现类似人类大骨节病的软骨坏死，但不发生在骺板软骨；低硒复合TDP-1则引起实验动物出现软骨发育不良症。
尽管已经表明镰刀菌毒素与大骨节病的发生可能有一定的联系，但仍有许多问题需要进一步研究：是单一毒素(何种镰刀菌毒素)还是多种毒素联合作用？如何解释疾病发生的地方性分布和个体特异性问题？特别是近20年来的研究认为，环境硒缺乏是大骨节病发生的一个重要因素之一，但不是原始病因。因此，某种或几种镰刀菌毒素是否与硒缺乏联合可致大骨节病软骨细胞坏死，非常值得深入研究。
3 饮水中有机物中毒说
饮水中有机物中毒说(hypothesis of high humic acid levels in the drinking water)认为，大骨节病是病区饮用水被植物分解残骸或腐殖质污染从而形成有机物污染导致人体发生的一种慢性中毒性疾病，其中有机物主要是指自然腐败的分解产物阿魏酸(ferulic acid)、对羟基桂皮酸(p-hydrocinnamic acid)、黄腐酸(fulvic acid，FA)等。我国民间及早年俄国学者均曾提出本病与水质有关。1908年我国刘建封就把本病起因归之于水质不良［32］，1926年前苏联学者M.I. Dobrovolsky提出病区饮水中有慢性毒物并建议饮用煮沸水［32］。1967年日本学者Noguchi提出水中的植物型有机物与大骨节病发病有关，并认为病区饮水中提取的阿魏酸、对羟基桂皮酸是大骨节病致病因子［33］。我国学者发现大骨节病病区饮水偏酸性，饮水中有机物总量和腐殖酸等明显高于非病区。因此，认为大骨节病病区饮水中有机物中毒是大骨节病的病因之一［1，34-35］，并提出了如下主要论据：①大骨节病病区饮用水源类型与病情密切相关：病区人群饮开水者大骨节病检出率明显的低，提示饮用水经煮沸可破坏或减弱致病因子的毒害；②饮用水中腐殖酸总量、羟基腐殖酸含量与大骨节病患病率呈正相关，与硒含量呈负相关［35］。病区饮水源受腐殖质环境污染，病区饮水中腐殖酸总量高于0.5 mg/L，腐殖酸(-OH)含量与大骨节病X线检出率呈对数相关和线性相关(相关系数=0.387-0.569)；③大骨节病病区饮水中腐殖酸的成分主要是黄腐酸、阿魏酸、对羟基桂皮酸［34-35］；也有检出硫酸软骨素酶(CHS)的厌氧菌［36］、含苯环有机物(芳香烃、烷基苯酚)［37］；④黄腐酸能促进体外培养软骨细胞及基质发生矿化，导致成骨，而这种异常矿化过程与病人软骨损伤及修复性的病理矿化过程相似［38］。从病区饮水中提取腐殖酸可加速培养的人胚软骨细胞分化、干扰细胞膜完整性、增强脂质过氧化的作用；而人工合成的腐殖酸(SHA)和原儿茶酸(protocatechuic acid， PCA)可损伤原代培养兔关节软骨细胞，降低细胞活力，使软骨细胞磷脂发生过氧化，细胞内LDH释放增加［39］。3H标记的FA可掺合到大鼠的骨和软骨组织中。腐殖酸又可致实验大鼠膝关节软骨细胞变性、软骨表面纤维化，类似于原发性骨关节病的早期病变；⑤病区改水后可使大骨节病的病情大幅度下降，病情活跃程度得到有效抑制，例如吉林省抚松县平安屯(1952-1961年)改饮不发病的泉水后，新发病例远少于继续饮用土井水的对照组。
然而，饮水中有机物中毒假说目前仍有一些难以解释的问题：①饮用同一水源水的自然屯，其大骨节病发病具有家庭聚集性倾向；重病区与非病区、病户与非病户之间饮水中腐殖酸含量的差异无显著性［40］；②用病区饮水提取的高浓度的黄腐酸不能引起培养的软骨细胞发生病变，也不能复制出大骨节病的实验动物模型，且对器官和组织无选择性，软骨未表现出有结合腐殖酸的嗜性、亲和性或蓄积作用［41-42］，实验结果不支持黄腐酸是大骨节病的始动病因。
4 环境因素致大骨节病软骨损伤的机制
大骨节病病因发病机制研究已经从环境的可疑因素、人群、个体、器官、组织细胞的水平向软骨细胞分化调节因子及其相关基因方向发展。早期研究表明大骨节病不但有软骨损害而且伴有心肌、骨髓、骨骼肌、血管壁、胃、内分泌腺和外周神经的损害，表现有内源性硫代谢障碍以及软骨代谢、脂质过氧化和硒代谢障碍等［43］。20世纪中期，我国学者莫东旭等经过系统的病理学研究，明确了大骨节病主要侵犯儿童发育中软骨内化骨型骨骼的骺软骨、骺板软骨和关节软骨的深层软骨细胞，先发生软骨坏死，继而发生软骨内化骨障碍和畸形性关节病［44］。这一研究成果不但是确定大骨节病及与其他骨软骨病、骨关节病鉴别的主要病理学依据，而且也是进行筛选和验证环境因素能否致大骨节病的要点之一。
大骨节病除经典的深层软骨细胞坏死等病变外，近年还发现有软骨细胞“去分化”以及胶原表型、甲状旁腺激素相关肽(parathyroid hormone-related peptide， PTHrP)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β， TGF-β)、碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor， bFGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)等的表达异常，表明大骨节病的发生不但涉及后来的软骨内化骨障碍还涉及发生略早的软骨细胞终末分化障碍［45］。实验培养大骨节病患者的关节软骨细胞已进一步证实软骨细胞的“去分化”、提前肥大老化和细胞外基质蛋白的代谢异常［46］。大骨节病软骨细胞过度凋亡及其调控因子B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2， Bcl-2)、Bax、Fas、诱生型一氧化氮合酶 (inducible nitric oxide synthase， iNOS)表达异常［47］，并且与血清一氧化氮(nitric oxide， NO)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase， NOS)、iNOS水平增高相一致［48］。
以大骨节病软骨深层细胞坏死、“去分化”和细胞过度凋亡为指标验证大骨节病环境致病因素的研究表明，病区水粮饲养的动物软骨可出现类似人类大骨节病的软骨病变，但究其为何种物质所致则尚不明确；低硒饲料复合T-2毒素、MON可致小型猪关节软骨出现灶状坏死但骺板软骨未出现病变；金属元素铊和硅可引起实验动物软骨细胞深层坏死，但其在病区与非病区水粮中的含量无显著性差异。环境低硒/和低碘因素与大骨节病有关，低硒低碘较单一低硒或低碘对实验三代大鼠骺板与关节软骨细胞分化与凋亡有显著影响，但均未观察到类似人类大骨节病的软骨细胞坏死［16］。
20世纪中期，我国发现大骨节病儿童软骨DNA含量减少，血浆蛋白质和氨基酸发生异常。近年来采用Agilent基因芯片检测培养的大骨节病患者的软骨细胞，发现上调和下调2倍以上的79个基因中有涉及代谢、细胞外基质、细胞凋亡和增殖、细胞膜蛋白/受体、细胞骨架的差异表达基因等［49］。采用SELDI/TOF-MS(surfaced enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry)蛋白组学芯片技术发现大骨节病患者15 886、5 336、6 112 m/z等16个血清差异表达蛋白标志均不同于居住在病区内、外的对照者与骨关节病患者；由这3个蛋白组成的大骨节病疾病分类树模型，特异度为88.89%，灵敏度为86.36%［50］。这些研究证据提示，大骨节病发生发展中软骨细胞的差异基因表达谱和血清差异蛋白表达谱已不同于病区与非病区的健康人群以及骨关节病的患者。
5 大骨节病家庭聚集性与环境反应基因的研究
大骨节病在病区内并非村村、家家、人人都患大骨节病。在环境有害因素暴露相同的病区，可发生靶位器官损害完全不同的地方病；例如环境低硒地区有大骨节病和克山病共存区、单纯大骨节病病区、单纯克山病病区。大骨节病多侵犯病区当地居住的农民，但也损害从非病区来的迁入者。早在1920年俄罗斯外贝加尔区的大骨节病家庭中就见到有传代现象［1］，曾认为本病是一种“窝子病”，即家庭多发。例如，王志武等调查大骨节病发现有家庭聚集性，发现患病率从10%到90%之间的病区都存在明显的家庭聚集性，但又绝对不是一种家族性遗传病［51］。我国曾先后调查表明，大骨节病双亲和同胞的患病危险度比非血缘亲属高3-4倍，大骨节病核心家庭子1代患病有家庭聚集性，不但受轻、中、重病区类型的影响，还与父母亲患大骨节病的表现型有关［52］。大骨节病的最小发病年龄为出生后97 d的婴儿，在新生儿和晚期胎儿曾检出软骨坏死的少数病例，但在胚胎发育早、中期均未见任何线索。由此可见，大骨节病是一种后天获得性疾病或可以说是一种起源于环境因素为主的复杂疾病。然而，即使是在患病率高的病村或者大骨节病患病率非常严重的家庭，指示病例的同胞中仍有不发生大骨节病的个体，提示大骨节病的发病具有个体差异。
我们采用短串联重复序列(short tandem repeat， STR)技术检测出第2、11和12号染色体与大骨节病相关的6个/64 STR基因位点，其中3个STR基因位点位于12q24.31-q24.33，接近于美国报道的手部骨关节病关联的12q24.33 STR位点，提示长期暴露在大骨节病病区环境因素下可影响人类遗传标志STR多态性的基因频率［52］。
6 对大骨节病发生本质的认识
在研究大骨节病病因与发病机制的历史过程中，不同学者从临床、病理学和流行病学等多学科方面，对大骨节病发生的本质提出不同的认识，对临床、鉴别诊断和防治具有重要指导意义，主要进展［54］有：①从1859年至1936年学界认为它是一种慢性、变性、畸形性骨关节炎，反映了大骨节病晚期关节病变的属性，并且认为本病不是炎症，而是营养不良，主要侵犯骨和软骨，致骨发育障碍，是一种地方性畸形性骨关节病；②1943年，前苏联的学者曾认为本病是一种选择性损害软骨化骨型骨骼的食物性镰刀菌中毒症(food fusariotoxicosis)；③1968年至1975年已认识到本病损害干骺与骨骺软骨，是地方性软骨内骨发育不全(dysostosis enchondrosis endemica)；世界卫生组织也将本病划入“其他和非特异性关节病”；④1990年至1994年美国学者Sokoloff认为本病是获得性软骨坏死(acquired chondronecrosis)，我国莫东旭通过对人类大骨节病与动物骨软骨病(osteochondrosis， OC)的病理学比较研究，认为本病是人类地方性骨软骨病(osteochondrosis endemica humanis)；殷培璞则从临床学研究角度认为是地方性慢性骨关节病(endemic chronic osteoarthrosis)，钱致中从骨与软骨放射学的变化提出是一种外因性骨代谢或营养障碍；我国卫生部也将大骨节病定义为地方性变形性骨关节病(endemic deformed osteoarthrosis)；⑤2004年国际骨骼疾病分类表将大骨节病分类为地方性畸形性骨关节病(osteoarthritis deformans endemica)。
7 展望
大骨节病的发病与多种环境因素有关。但是，这些环境因素中究竟有哪几种或何者为主何者为辅，又如何特异性地损害大骨节病人体骨骼内的深层软骨细胞，是破解大骨节病病因发病与流行的关键点。随着人类基因组、后基因组和环境基因组学研究的进展，大多数疾病实质上是由基因/易感基因型和环境因素相互作用所致。因此，利用现代分子生物学技术及生物信息学技术，开展从环境-人群-细胞-分子-基因-蛋白不同层次和水平上筛选和确定大骨节病软骨坏死发生的环境暴露效应和生物学标志，则可以更深入地认识大骨节病发生的本质。
大骨节病的损伤不但涉及软骨组织与细胞的变化，而且还涉及基因、蛋白和代谢水平上的变化。因此，应继续推进大骨节病差异基因表达谱、蛋白组学和代谢组学方面的研究，从不同水平上系统阐述大骨节病软骨损害的整体性变化及其机制。籍此为基础，还应开展大骨节病软骨细胞模型建立的研究，以用于筛选和验证大骨节病致病因素。此外，在继续研究大骨节病环境致病因素的干预措施的同时，更应加强大骨节病软骨坏死发生机制的生物学干预技术研究，开展大骨节病基因治疗、组织工程修复软骨缺损和药物作用靶点的研究，为临床上应用新药、生物填充疗法和手术治疗大骨节病提供科学新依据。
应开展大骨节病人群易感基因或环境反应基因的筛选与定位研究，以推进大骨节病易感人群特征的研究。由于大骨节病环境因素入侵活体内选择性地损伤软骨细胞机制的复杂性，使得在获得大骨节病易感基因和软骨细胞坏死过程中细胞损伤的相关基因后，还必须考虑其与大骨节病环境暴露因素的相互作用模型，阐明大骨节病环境致病因素是如何与大骨节病易感基因或环境反应基因相互作用从而选择性地损伤深层软骨细胞的分子发病机制。
总之，我国的大骨节病病因发病机制研究已取得了显著进展。这对提高我国大骨节病防治策略提供了重要的支撑。然而，大骨节病的病因发病机制的研究任务仍然十分艰巨，必须长期持续地对关键问题进行深入研究。运用现代生物学技术，围绕大骨节病的环境因素和易感基因相互作用这一重点去研究大骨节病软骨细胞损伤及其修复的分子生物学机制，将对提高大骨节病的早期诊断、早期预防和建立预警体系的理论和技术，具有重要作用。
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