β分泌酶底物肽对阿尔茨海默病细胞模型的保护作用

　　　　 作者：崔媛媛，师社会，胡海涛，董炜疆

【摘要】 目的 探讨β分泌酶底物肽(BACEsp)对阿尔茨海默病(AD)细胞模型保护作用的机制。方法 用携带BACEsp基因的重组病毒pLXSNBACEsp(pBV)，作用经淀粉样前体蛋白(APP)转染SKNSH细胞建立的AD细胞模型。MTT法检测细胞的活性，免疫细胞化学方法观察BACEsp作用前、后细胞内APP表达量的变化。结果 pBV预处理组细胞的活性、胞内APP的表达量显著高于AD模型组和pBV后处理组。结论 BACEsp对由APP所造成的AD细胞模型的神经毒性具有明显的保护作用。

【关键词】 阿尔茨海默病;β分泌酶底物肽;AD细胞模型

　　ABSTRACT:Objective To study the effect of βscretase substratebase peptide (BACEsp) on cellular model of Alzheimers disease (AD). Methods The cellular model of AD established with neuroblastoma cell SKNSH induced by amyloid precursor protein (APP) was infected with the supernatants including recombinant retrovirus pLXSNBACEsp. MTT assay was used to test cell viability and immunocytochemistry was used to observe APP expresion in cells before and after BACEsp treatment. Results Cell viability and APP expression in the cells that had been first infected by recombinant retrovirus pLXSNBACEsp were apparently higher than those only transfected by APP and last infected by recombinant retrovirus pLXSNBACEsp. Conclusion BACEsp has an obviously protective effect on APPinduced neuron toxicity of cellular model of AD.

　　KEY WORDS: Alzheimers disease (AD); βscretase substratebase peptide (BACEsp); cellular model of AD

　阿尔茨海默病(Alzheimers disease， AD)是老年人最常见的神经退行性疾病之一。研究表明，β淀粉样肽(βamyloid peptide， Aβ)是AD发生的主要原因[12]。Aβ是淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein， APP)经β分泌酶(βsecretase， BACE)和γ分泌酶共同裂解产生的，因此减少Aβ最有效的方式是抑制β分泌酶或γ分泌酶的产生。目前，在减少Aβ产生的许多方法中最便捷的就是通过直接抑制BACE来减少Aβ的生成，因此抑制BACE已成为设计治疗AD药物的重要靶点[34]。本研究以重组病毒pBV介导BACEsp基因整合入AD模型的细胞基因组，使BACEsp基因随细胞的增殖而表达，进而与APP竞争性结合β分泌酶，达到减少Aβ产生的目的，为进一步研究BACEsp的作用、寻求预防和治疗AD的有效措施奠定了重要的基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂及仪器 神经母细胞瘤SKNSH细胞株购自中科院上海细胞库;Lipofectamine 2000TM购自GIBCO公司;兔抗人APP抗体和SABC免疫组织化学试剂盒(即用型)购自武汉博士德生物公司;引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。LeicaDM16000B 型图象分析系统(德国);ELx800型酶标仪(美国)。

　　1.2 细胞培养及G418筛选 SKNSH细胞用含100mL/L FBS的DMEM[H]培养液，37℃、50mL/L CO2常规条件下培养，常规胰酶消化传代。以0～1100μg/mL共12个浓度梯度加入G418，以最低细胞全部死亡浓度为基准，定为SKNSH细胞的G418筛选浓度。

　　1.3 pBV感染的检测 本实验室在前期实验中成功得到了携带BACEsp基因的重组病毒pBV，以pBV感染过的SKNSH细胞基因组DNA为模板，以BACEsp基因扩增的上游引物(5′CGGAATTCGTTACCATGACAAATATCAAGACGGAGG

　　AGATCTCTGAAGTG3′)为引物，进行PCR反应。反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环后，72℃延伸5min。反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

　　1.4 AD细胞模型的建立 SKNSH细胞培养于经多聚赖氨酸处理的96孔板，37℃、50mL/L CO2常规条件下培养48h，待细胞密度约为90%时换液，加入经Lipofectamine 2000TM介导的APP转染液100μL/孔，培养96h，建立AD细胞模型。

　　1.5 实验分组 本实验共分5组：空白对照组、正常对照组、AD细胞模型组、pBV后处理组、pBV预处理组。前3组均以含100mL/L FBS的DMEM[H]培养，不经pBV作用，pBV后处理组以pBV感染AD模型细胞，pBV预处理组是用APP转染预先经pBV感染过的SKNSH细胞。

　　1.6 细胞活性检测 各组细胞以2×105/mL的密度种入经多聚赖氨酸处理的96孔板，常规培养48h后更换培养液，经相应处理96h后，加入MTT 20μL，37℃、50mL/L CO2条件下培养4h，弃上清;加入DMSO 150μL/孔，充分震荡10min，酶标仪于490nm波长测定A值。

　　1.7 免疫细胞化学检测 各组细胞以2×105/mL密度接种于经多聚赖氨酸处理的盖玻片上，在相应条件下培养48h，预冷PBS洗3次;40g/L多聚甲醛溶液固定，PBS洗3次;1mL/L TritonX100 15min，PBS洗3次;3mL/L h3O2 30min，PBS洗3次;入一抗(APP浓度1∶300)，4℃过夜，PBS洗3次;入鼠抗兔二抗，37℃孵育30min，PBS洗3次;SABC复合物，37℃ 30min，PBS洗3次;DAB显色5min，至棕色，蒸馏水洗2次，终止DAB反应;甘油封片，镜下观察，LeicaDM16000B 型图像分析系统进行数据分析。

　　1.8 统计学处理 所有数据均采用SPSS13.0软件包分析。实验结果以数据和图表的形式表示，测定值以均数±标准差(±s)表示，多组间均数比较用单因素方差分析，两组间比较采用Student t检验。P<0.01为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 SKNSH细胞的G418筛选 SKNSH细胞经400mg/L G418筛选，10d后大部分细胞变小，形态由原来的多边形、有突起变得边界不清，突起消失，多个细胞融成一体，细胞出现飘浮现象，数量明显下降。故将SKNSH细胞的G418筛选浓度定为400mg/L(图1)。

　　2.2 pBV感染的检测结果 PCR方法检测pBV感染后的SKNSH细胞基因组，可得到218bp大小的片段，证明BACEsp基因已整合入SKNSH细胞基因组中(图2)。

　　2.3 各组细胞活性的比较 以正常对照组细胞的A值记为100%，AD模型组和pBV后处理组较正常对照组的细胞活性明显降低，差异有统计学意义(P<0.01);pBV预处理组与正常对照组的细胞活性相近，差异无统计学意义(P>0.05)，与AD模型组相比细胞活性高，差异有统计学意义(P<0.01，表1)。

　　2.4 APP蛋白的表达情况 正常对照组中未见免疫反应染色阳性的细胞，AD模型组、pBV后处理组及pBV预处理组均可见免疫反应染色阳性细胞。与正常对照组相比，pBV预处理组APP染色最强。测定APP免疫反应阳性的灰度值，灰度值与蛋白的表达量呈反比关系(表1、图3)。表1 不同因素处理后SKNSH细胞的活性及APP蛋白表达量的变化

　　3 讨 论

　　AD是老年人中发病率最高、危害最大的中枢神经系统退变性疾病。脑内Aβ的沉积所引发的淀粉样蛋白级联反应是AD病理过程中的重要步骤。实验证实，BACE是体内主要的β分泌酶，抑制BACE的活性在体内不会引起细胞毒性;缺失BACE基因的小鼠脑中Aβ显著降低至检测限度以下。表明可以通过抑制BACE的活性来降低Aβ的水平，达到控制或减缓AD症状的目的[5]。

　　本研究所用的AD细胞模型是由APP诱导神经母细胞瘤细胞SKNSH建立的[6]。SKNSH细胞不仅具有神经元的特性，还因可表现AD的细胞特性而用于有关AD的研究。pLXSN反转录病毒载体源于Moloney小鼠白血病病毒(MoMuLV)，它所介导的基因转移具有将外源性基因插入靶细胞基因组后，使外源性基因在靶细胞内长效表达且安全性较高的特点[7]。

　　本研究结果显示，pBV先感染SKNSH，再以APP转染，其细胞活性与正常SKNSH无显著性差异;与之相反，先用APP转染SKNSH，再以pBV感染细胞，细胞活性较正常SKNSH活性明显降低。同时，免疫细胞化学结果显示，先以pBV感染，再以APP转染的SKNSH内APP的表达量显著高于单独以APP转染的细胞。这可能是由于先感染入细胞内的BACEsp与BACE竞争性结合，使APP裂解减少，Aβ生成减少，从而对AD模型细胞起到了保护作用;而先转染APP的细胞，APP很快就会被BACE裂解，产生Aβ，造成细胞损伤，此时尽管也加入BACEsp，但只能减缓Aβ再生成的速度，而无法改变由Aβ已经造成的细胞损伤。由此可见，BACEsp对细胞的保护作用可能是预防性的，对已经产生的Aβ造成的细胞损伤是无法逆转的。

参考文献

　[1]COLE SL， VASSAR R. The role of amyloid precursor protein processing by BACE1， the betasecretase， in Alzheimers disease pathophysiology [J]. J Biol Chem， 2008， 283(44):2962129625.

　　[2]高林，陈烈冉，贾延，等. 海马区注射Aβ1-42对不同年龄大鼠记忆能力和脑内Aβ1-42沉积的影响 [J]. 郑州大学学报：医学版， 2006， 41(2):311313.

　　[3]胡海涛，董炜疆. 阿尔茨海默病防治研究的现状与展望 [J]. 西安交通大学学报：医学版， 2007， 28(1):15.

　　[4]RIZZI L， VAIANA N， SAGUI F， et al. Design， synthesis and docking studies of hydroxyethylamine and hydroxyethylsulfide BACE1 inhibitors [J]. Protein Pept Lett， 2009， 16(1):8690.

　　[5]GHOSH AK， DEVASAMUDRAM T， HONG L， et al. Structurebased design of cycloamideurethanederived novel inhibitors of human brain memapsin 2 (betasecretase) [J]. Bioorg Med Chem Lett， 2005， 15(1):1520.

　　[6]CASULARI LA， DONDI D， MAGGI R， et al. Dexamethasone blocks the migration of the human neuroblastoma cell line SKNSH [J]. Braz J Med Biol Res， 2006， 39(9):12331240.

　　[7]崔媛媛，胡海涛，董炜疆，等. β分泌酶底物肽反转录病毒载体及其包装细胞株的构建 [J]. 西安交通大学学报：医学版， 2007， 27(6):624626.