PEG5000修饰后假丝酵母尿酸酶的基本特性

　　　　　　作者：孙晓军 金磊 甘志勇 刘冬

【摘要】 　　目的 研究天然尿酸酶与PEG化尿酸酶的基本特性，为治疗高尿酸血症相关疾病药物做基础研究。方法 用相对分子量5 kD，活化基团为羟基琥珀亚氨的PEG作为专一性修饰剂对尿酸酶进行修饰，采用常规酶学分析方法，分别研究天然尿酸酶与PEG化尿酸酶的动力学参数，并比较修饰前后对抑制剂黄嘌呤的敏感性、最适温度、最适pH值、37℃时的稳定性以及在体半衰期等方面的差异。结果 经PEG修饰后尿酸酶最适温度由30℃升为35℃，最适pH无改变仍为pH8.7；在37℃水浴下，24 h后活性保留由40%增至70%，酶稳定性提高，体内半衰期由45 min延长至11 h；测定尿酸酶和PEG化尿酸酶的Km分别为32.40、36.34 μmol/L，黄嘌呤对尿酸酶与PEG化尿酸酶抑制常数分别为4.72、11.30 μmol/L。结论 假丝酵母尿酸酶经PEG 5 kD修饰后有药用潜力。

【关键词】 高尿酸血症；尿酸酶；PEG修饰；稳定性

　　【Abstract】 Objective To research the basic characteristics of natural uricase and PEGuricase， prepare PEGuricase， modify the Candida uricase with PEG5000 to improve the stability of the Candida uricase and extend the halflife of uricase in vivo.Methods PEG(relative molecular weight 5 kD， activation group for the NHS Asian ammonia) was used as a pecial modifier to modify uricase. With the conventional enzymatic analysis， some kinetic parameters of natural uricase and PEGuricase were studied， and compared the differences of the sensitivity of the inhibitor of xanth， optimum temperature， optimum pH， the stability at 37℃ and the halflife in vivo before and after modification. Results It was demonstrated that after
PEG modification the optimal temperature of the uricase was upgraded from 30℃ to 35℃，the optimum pH was still 8.7 with no changing .37 ℃ water bath，24 h postactive retention increased from 40% to 70%， the enzyme stability was improved， the halftime in vivo extended from 45 min to 90 min.The Km of uricase and PEGuricase were 32.40 and 36.34 μmol/L， the inhibition constants of xanthine on uricase and PEGuricase were 4.72， 11.30 μmol/L. Conclusions PEGmodified uricase from the Candida utilis is promising to be a biodrug for treating hyperuricemia.
　　
　　【Key words】 Hyperuricemia；Uricase；Pegylation；Stability

　　尿酸为嘌呤分解终产物并主要通过肾脏排泄，血清尿酸水平是肾脏功能监测的有效指标。尿酸酶（uricase，EC1.7.3.3)专一催化氧化尿酸生成尿囊素、二氧化碳和过氧化氢，广泛用于临床检验领域测定血清尿酸。人体内缺乏尿酸酶时血清尿酸过高，易造成高尿酸血症，是心血管疾病、痛风等的主要诱因〔1，2〕。细菌、假丝酵母菌等微生物〔3～6〕及多数植物和低等动物都有活性尿酸酶。多数尿酸酶最适pH在8.5以上，但人体血浆pH接近7.4，在血浆中有较高比活性的尿酸酶才是理想的药用尿酸酶〔7〕。真菌尿酸酶在人体血浆中能保留较高的比活性，是理想的药用尿酸酶来源〔8〕，很早就有人尝试用假丝酵母尿酸酶治疗高尿酸血症，但至今没有成功开发出治疗高尿酸血症的药物蛋白。本文用相对分子量为5 kD、活化基团为羟基琥珀亚氨的PEG作为专一性修饰剂，对产朊假丝酵母菌所产的尿酸酶进行修饰，以提高产朊假丝酵母尿酸酶的稳定性，延长在体半衰期，为药用尿酸酶奠定基础。

　　1 资料与方法

　　1.1 材料与试剂

　　假丝酵母菌（C.G.M.C.C.2.1008）来自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，尿酸来自Alfa Aesar，黄嘌呤来自Avocado，DEAEcellulose 52来自Whatma。其他试剂为国产分析纯。

　　1.2 尿酸酶的制备及纯化

　　挑菌落接入麦芽浸膏培养基（麦芽浸膏3.0%，pH6.7），28℃，240 r/min振荡培养24 h；再与诱导培养基(葡萄糖5%，尿酸0.06%，K2HPO4 0.2%，MgSO4 0.05%，pH6.7)中〔10〕，28℃，240 r/min振荡培养5～6 h；在4℃ 4 000 r/min离心20 min收集菌体，用0.05 mol/L硼酸缓冲液pH8.0悬浮菌体；在4℃下用MSE超声仪，间隔10 s碎菌10 s，持续40 min；10 000 r/min离心15 min收集上清，30%～90%硫酸铵4℃将粗酶液分级；10 000 r/min离心收集沉淀，0.05 mol/L硼酸缓冲液4℃透析过夜；再将透析后的上清液过DEAEcellulose52纤维柱，收集酶活性部分。

　　1.3 PEG化尿酸酶的制备

　　标定透析后尿酸酶的浓度与活性，取20 ml 0.2～0.3 mg/ml的尿酸酶与PEG5000以摩尔比1∶200比例混合，于4℃混匀1 h。

　　1.4 尿酸酶与PEG化尿酸酶的活力测定和表征

　　1.4.1 酶活力测定

　　反应体系1.2 ml，含1.156 ml硼酸盐缓冲液，溶解在二甲基亚砜3.75、尿酸0.024和0.050酶液样品中，在25℃条件下测定酶作用下293 nm吸收变化初速度（延迟30 s后共记录1.0 min），每分钟氧化1.0 μmol尿酸的酶量为1个单位。

　　1.4.2 尿酸酶与PEG化尿酸酶米氏常数的测定

　　用pH8.8硼酸盐缓冲液反应体系，在25℃条件下测定10.0、20.0、40.0、60.0、80.0 μmol/L终浓度尿酸下的初速度，用LineweaverBurk plot法回归分析初速度对底物浓度的影响以测定动力学参数。

　　1.4.3 黄嘌呤对尿酸酶与PEG化尿酸酶抑制常数的测定

　　用pH8.8硼酸盐缓冲液反应体系，在25℃测定黄嘌呤抑制作用，即回归动力学参数随着抑制剂浓度的变化，从而确定抑制类型和对应抑制常数。

　　1.4.4 最适pH测定

　　将测酶活性缓冲液及尿酸配成pH7.2～9.0硼酸硼砂缓冲液，将酶分别预先加入缓冲液中25℃孵育1 h，将尿酸同样放在25℃温浴1 h，将二者混匀，按测定尿酸酶活性的方法测定尿酸酶和PEG化尿酸酶的活性，以pH为横坐标，尿酸酶与PEG化尿酸酶相对活性为纵坐标作图。

　　1.4.5 最适温度的测定

　　将待测的酶缓冲液和尿酸分别放置在5℃，10℃，20℃，30℃，40℃，50℃，60℃中，将酶预先放置在0℃，按测定尿酸酶活性的方法测定尿酸酶和PEG化尿酸酶的活性。以温度为横坐标，尿酸酶与PEG化尿酸酶相对活性为纵坐标作图。

　　1.4.6 尿酸酶与PEG化尿酸酶在37℃时的稳定性测定

　　将待测酶液放入37℃水浴温育，分别在1、2、4、6、8、12、14、16、18、20、24、27、33、48 h按测定尿酸酶活性的方法测定尿酸酶和PEG化尿酸酶的活性。以时间为横坐标，尿酸酶与PEG化尿酸酶相对活性为纵坐标作图。

　　1.4.7 尿酸酶与PEG化尿酸酶在体半衰期测定

　　雄性大鼠10只，尾静脉注射尿酸酶每只1 U，在5、10、20、40、60 min及2、4、6、8 h时眼球取血，3 600 r/min 离心10 min，取上清，冷冻备用。25℃温浴缓冲液，将血清预先放置在25℃，按测定尿酸酶活性的方法测定血浆中尿酸酶和PEG化尿酸酶的活性。以时间为横坐标，以血浆中尿酸酶与PEG化尿酸酶的活性为纵坐标作图。

　　1.4.8 实验组离体多次降尿酸实验评价尿酸酶的药效

　　取大白兔(n=2)静脉血液约80 ml，离心获得血浆约20 ml。用20 ml血浆模拟体内环境，分装于5个5 ml管中，加入一定的尿酸和黄嘌呤抑制剂，标定尿酸与黄嘌呤浓度（尿酸终浓度为800 μmol/L，黄嘌呤总浓度为300 μmol/L）。混匀后各吸取给药前的血浆作为对照组，然后置于37℃烘箱中，待温度稳定后加入尿酸酶0.02 U/ml，摇匀后分别在5、15、30、45、60、90、120、135、140、160、180、200、230、255、280、300、330、360 min时取样，分别在120、240 min时在原体系中继续加入700 μmol/L尿酸，600 μmol/L，分析血浆中尿酸的变化值。

　　2 结果

　　2.1 PEG化尿酸酶与天然尿酸酶SDSPAGE电泳图　见图1。

　　2.2 尿酸酶与PEG化尿酸酶的基本特征

　　2.2.1 尿酸酶与PEG化尿酸酶的动力学参数

　　在（25±0.5）℃且pH8.8时，天然尿酸酶米氏常数(K)为32.40 μmol/L，黄嘌呤不改变其最大反应速度，但使其K显著升高，对应抑制常数为4.72 μmol/L。同理测得PEG化尿酸酶K为36.34 μmol/L，对应抑制常数为11.30 μmol/L。见图2。

　　2.2.2 尿酸酶与PEG化尿酸酶的其他基本特征

　　尿酸酶与PEG化尿酸酶的最适pH同为8.7，在pH7.4时PEG化尿酸酶保留活性优于天然尿酸酶。天然尿酸酶的最适温度为30℃，PEG化尿酸酶的最适温度为35℃，当温度超过50℃，两者活性下降很快。PEG化尿酸酶在37℃时的稳定性明显优于天然尿酸酶。天然尿酸酶在大鼠体内半衰期是15 min左右，经PEG修饰后尿酸酶在体半衰期延长至11 h。见图3。

　　2.3 尿酸酶与PEG化尿酸酶离体模型评价尿酸酶的药效

　　可以看到持续3轮，尿酸酶均将尿酸降至正常水平。故此尿酸酶可用于高尿酸血症的降尿酸药物。见图4。

　　3 讨论
　　
　　产朊假丝酵母菌在以尿酸为氮源时才表达尿酸酶，本文所用诱导培养基也可诱导表达尿酸酶，用0.05 mol/L硼酸缓冲液(pH8.0)平衡的DEAEcellulose52柱层析纯化该酶时，酶蛋白不吸附，表明此菌株产生的胞内蛋白和尿酸酶主要是碱性蛋白，这与文献报道的假丝酵母尿酸酶明显不同〔6〕。通过对此尿酸酶的表征测定发现，此尿酸酶在生理pH下保留50%左右的酶活性；37℃稳定性很好，对尿酸亲和力高。因此，此尿酸酶有药用潜力。本实验用相对分子量为5 kD，活化基团为羟基琥珀亚氨的PEG作为专一性修饰剂对尿酸酶进行修饰，修饰后保留65%的酶活性，与文献报道活性下降88%不同〔8〕。经PEG修饰后尿酸酶最适pH无改变，仍为8.7。有研究表明pH8.5的尿酸酶非常适合于临床应用〔9～11〕，最适温度由30℃升至35℃，接近人体体温。并且在体半衰期由40 min延长至90 min，因此经PEG 5 kD修饰后的尿酸酶较天然尿酸酶的药用潜力更大。通过定点突变改造有望降低其对黄嘌呤抑制作用的敏感性，延长在体半衰期，使得此酶的突变体有望成为药用蛋白。此工作目前正在进行中。

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