作者：吕军 姜树原 邵国 贾平平 周立社 闫少春
【摘要】 目的:研究钒化钠对食管癌细胞系EC109 Caspase-3激活的影响，探讨钒化钠影响食管癌细胞系EC109细胞生长的机制。方法:以体外培养食管癌细胞系EC109为研究对象，给予0、0.1、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、200.0μmol/L钒化钠，培养1小时后，用Western blot技术检测食管癌细胞系EC109 Caspase-3激活情况。结果:0、0.1、1.0、5.0、10.0μmol/L钒化钠组培养1小时后，各组Caspase-3蛋白激活与对照组比较均无统计学意义；50.0、100.0、200.0μmol/L钒化钠组培养1小时后，各组Caspase-3蛋白表达均升高。结论：高浓度的钒化钠可能激活EC109细胞Caspase-3蛋白。
【关键词】 钒化钠；EC109；Caspase-3
Abstract Objective : To study the effects of sodium orthovanadate on the activation of Caspase-3 in esophageal cancer cell line EC109. Methods: EC109 esophageal cancer cells grown in cell culture were treated with sodium orthovanadate for 1 hour at the dose of 0，0.1，1.0，5.0，10.0，50.0，100.0，200.0 μmol/L respectively. Whole cell extracts were harvested and subjected to Western blotting technique to examine the activation of Caspase-3. Results： There are no statistically significant changes for the activation of Caspase-3 after sodium orthovanadate treatment at the dose of 0.1，1.0， 5.0，10.0 μmol/L. However， the protein level of Caspase-3 markedly increases after sodium orthovanadate treatment at the dose of 50.0，100.0，200.0 μmol/L. Conclusion: Sodium orthovanadate at high dose may trigger the activation of caspase-3 in EC109 cells.
Key words Sodium orthovanadate； EC109 cell line； Caspase-3
食管癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，由于早期诊断率低，既使手术切除，预后仍较差，全世界每年约有30万人死于此疾病。寻找有效的化疗药物成为食管癌治疗领域研究的热点。Caspase-3是调控凋亡的关键蛋白酶，被称为死亡蛋白酶。活化的Caspase-3通过水解特异性细胞蛋白可直接导致细胞凋亡，也可破坏DNA修复蛋白，抑制DNA修复，协助细胞凋亡的完成。因此，Caspase-3的激活预示着细胞的凋亡[1]。本实验研究不同浓度钒化钠对食管癌细胞系EC109 Caspase-3蛋白激活的影响，探讨钒化钠对食管癌细胞系EC109的影响及其作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株 食管癌细胞系EC109购自上海细胞生物研究所。
1.1.2 试剂 RPMI1640培养基（Gibico公司），胎牛血清（杭州四季青生物材料有限公司），胰蛋白酶（上海华美生物工程公司），台盼兰（上海华美生物工程公司），二甲基亚砜（Amersco），聚丙烯酰胺凝胶、Caspase-3抗体、辣根酶标记山羊抗兔Ig抗体、ECL试剂盒购于北京中山公司，其他试剂均为分析纯。
1.1.3 仪器 二氧化碳培养箱（Thermoforma of THE U.S.A），倒置相差显微镜（XDB-1B，国产），超净工作台（SW-CJ-2F，上海博迅），自动双重纯水蒸馏器（SZ-98，上海本波仪器有限公司），手提式压力蒸汽消毒器（YXQ02型，山东），电热恒温鼓风干燥箱（Gzx-dh.500-bs，上海），电子天平（FA1004，上海恒平科学仪器公司），电泳仪（DF-D，北京），电转膜仪，紫外透视成像系统（KH-UVIII，上海康禾）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 食管癌细胞系EC109在37℃、饱和湿度及5%CO2条件下，用培养瓶在含10%胎牛血清、100Ｕ／mL青链霉素的RPMI1640培养液中传代培养。
1.2.2 Western blot技术 将食管癌细胞系EC109悬液接种于6孔培养皿中，培养至贴壁面积达80%～90%时弃去培养液，换上无血清培养基培养12 小时， 按实验分组分别加入不同浓度的钒化钠，分别为0.1、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、200.0μmol/L，对照组不加药物。作用1小时后，用RIPA+PMSF细胞裂解液在冰上裂解细胞，低温离心15分钟提取蛋白，BCA法蛋白定量。加上样缓冲液，100℃变性5分钟。每孔50μg蛋白上样，10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将蛋白电转到硝酸纤维膜上，用5%脱脂奶粉封闭1小时，加一抗稀释液(1∶1 000稀释)4℃过夜，TTBS洗膜，结合辣根过氧化物酶标记二抗(1∶5 000稀释)，TTBS洗膜，用ECL化学发光试剂在X光胶片上曝光、显影、定影。以β-actin为内参照，应用凝胶成像分析系统进行条带扫描分析结果，结果以蛋白条带的面积积分值与β-actin的面积积分值比值表示。实验重复3次。
1.2.3 统计学处理 采用SPSS11.0软件包对数据进行单因素方差分析，统计数据以均数±标准差（x±s）表示，P&<0.05为差别有统计学意义。
2 结果
随钒化钠浓度的增加，食管癌细胞系EC109 Caspase-3蛋白表达也增高，见图1。Western blot技术检测结果显示，低浓度(0.1～10.0μmol/L)钒化钠组Caspase-3蛋白表达与对照组比较均无统计学意义（P＞0.05）；50.0、100.0、200.0μmol/L钒化钠组培养1小时后，各组Caspase-3蛋白表达均高于对照组（P&<0.05），见表1。
图1 Western blot技术分析不同浓度钒化钠处理食管癌细胞系EC109 1小时Caspase-3和β-actin蛋白表达情况（略）
表1 不同浓度钒化钠对食管癌细胞系EC109 Caspase-3蛋白表达的影响（略）
*与对照组比较P&<0.05，**与对照组比较P&<0.01
3 讨论
钒是化学元素周期表中VB族的过渡元素，广泛存在于自然界中，参与人体许多生理过程，如细胞的生长和分化、糖类及脂类的代谢等[2]。Bishayee等［3］报道了一系列钒制剂对动物模型系统的抗肿瘤活性。最新研究表明，一种钒配合物LMC（氧原子配位的四价金属钒配合物）通过抑制DNA拓扑异构酶发挥抗肿瘤作用，对多种肿瘤细胞株A549、Hela、BEL-7402具有明显抑制生长的作用，且可将细胞阻断在G2/M期，而对正常肝细胞生长无明显影响[4]。
肿瘤的发生、发展与凋亡有密切关系。肿瘤不仅有细胞增殖和分化的异常，亦有细胞凋亡的异常。Caspase是参与诱导细胞凋亡的重要因素，Caspase-3是哺乳类动物细胞凋亡的关键蛋白酶[5]。Caspase家族存在于哺乳动物细胞中，是与线虫细胞死亡蛋白CED-3相似的一类蛋白酶，迄今已发现16个成员[6]，均以无活性的前体形式存在，一经激活，将产生Caspase级联反应，导致细胞凋亡。现今认为，Caspase的激活与细胞凋亡需经两条不同的途径:一条是通过与细胞表面的死亡受体结合，激活Caspase-8后，再活化下游的Caspase(主要为Caspase-3)；另一条是各种毒性物质刺激线粒体释放的细胞色素C，激活Caspase-9后，再活化下游的Caspase(主要也是Caspase-3)[7-8]。可见这两条途径均需激活Caspase-3。近年来发现Caspase-3参与了肿瘤发生过程中细胞凋亡异常的病理过程[6]，细胞凋亡的分子机制研究表明，凋亡是多基因参与的级联反应过程。其中Caspase-3是凋亡的执行器之一[9]。Caspase-3为凋亡的效应分子，是凋亡途径下游进行底物酶解的关键蛋白酶，被称为凋亡的“执行者”[10]。Caspase-3是多种凋亡途径共同作用的因子，其蛋白表达水平的高低决定着细胞凋亡程度[11]。
目前，以诱导凋亡为目标的肿瘤治疗战略主要是通过各种因子活化Caspase-3前体而实现的。本实验结果显示，不同浓度钒化钠作用食管癌细胞系EC109后1小时，低浓度钒化钠组对Caspase-3蛋白的表达无明显影响，高浓度组Caspase-3蛋白的活性增加。提示一定浓度的钒化钠可能通过激活Caspase-3而发挥其促进食管癌细胞系EC109细胞凋亡的作用。这一结果为钒化钠防治食管癌的临床应用奠定理论基础。由于细胞凋亡是一个极其复杂、涉及多步骤、多因子参与的过程，故钒化钠诱导肿瘤细胞凋亡的详细机制仍需进一步研究。
参考文献
[1] Yuan J，Yankner BA.Apoptosis in the nervous system[J].Nature，2000，407:802-809.
[2] Stern A，Yin X，Tsang SS，et al.Vanadium as a modulator of cellular regulatory cascades and oncogene expression[J].Biochem Cell Biol，1993，71:103-112.
[3] Bishayee A，Chalterjee M.Inhibitory effect of vanadium on rat liver carcinogenesis initiated with diethyl nitrosamine and promoted by Phenobarbital[J].Br Cancer，1995，71:1214-1220.
[4] 莫晓媚，李静，李延团，等.一种钒配合物LMC抑制DNA拓扑异构酶的抗肿瘤作用[J].现代生物医学进展，2006，6（4）：13-14.
[5] Grub S，Persohn E，Trommer WE，et al.M echanisms of cyclosporine A -induced apoptosis in rat hepatocyte primary cultures[J].Toxicol Appl Pharmaccol，2000，163(3):209 -220.
[6] Nicholson DW，Ali A，Thornberry NA，et al.Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis[J].Nature，1995，376(6535):37-43.
[7] Marks N，Berg MJ.Recent advances on neuronal caspase in development and neurodegeneration[J].Neurochem Int，1999，35(3):195-220.
[8] Thornberry NA，Lazebnik Y.Caspases:enemies within [J].Science，1998，28l(5381):1312-1316.
[9] 林春龙，张珍祥. FAK反义寡核苷酸促进人肺动脉平滑肌细胞凋亡[J].中国病理生理杂志，2006，22(2):288-291.
[10] 吕必华，张玲，刘静.COX-2抑制剂 NS-398对肝癌HepG2细胞凋亡蛋白Bcl-2和Caspase-3表达的影响[J].公共卫生与预防医学，2007，18（4）：21-22.
[11] Krajewska M，Wang HG，Krajewaki S，et al.Immunohistochemical analysis of in vio pattens of expression of p32(caspase-3)，a cell death protease[J].Cancer Res，1997，57(8):1605-1613.