缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑组织水通道蛋白9实验研究表达

【摘要】 目的 研究缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后水通道蛋白9(AQP9)在脑组织中的表达变化规律，初步探讨AQP9与脑水肿的关系。方法 采用HIBD动物模型，实施定量PCR(基因水平)和WesterBlot(免疫印迹)方法，检测AQP9表达的变化和AQP9 mRNA的变化。结果 HIBD组AQP9的表达随缺血时间延长而表达增加，对照组AQP9表达无明显变化，且AQP9表达在脑缺血2～3 d表达最强。结论 HIBD时，随着缺氧缺血时间的延长，AQP9表达增强，至72 h达高峰。

【关键词】 脑损伤/病理学; 脑缺血; 脑缺氧; 脑水肿; 水通道蛋白9; 大鼠; 动物，实验

　　【Abstract】 Objective To study the change pattern of AQP9 expression in the brain tissues after hypoxicischemic brain damage and to discuss its relationship with brain edema.Methods HIBD animal model was established，and quantitative PCR and WesternBlot were used to determine the changes of AQP9 expression and AQP9 mRNA.Results AQP9 expression had no obvious change in the control group，but in the HIBD group，AQP9 expression increased with the lasting time of ischemia，and it reached its highest level on the second and third day of ischemia.Conclusions In hypoxicischemic brain damage，AQP9 expression increases with the lasting time of hypoxia and ischemia，and it reaches its highest level at 72 hours.

　　【Key words】 Brain damage/pathology; Cerebral ischemia; Cerebral hypoxia; Cerebral edema; AQP9; Rats; Animal，experiment

　　缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后，大脑组织将发生一系列的病理生理变化。其中能量代谢变化和水电解质平衡的紊乱始终贯穿于HIBD。研究表明，水通道蛋白9(aquaporin9，AQP9)与大脑的能量代谢和水电解质平衡密切相关[1]。因此研究HIBD后AQP9的表达，探索其在HIBD不同时间段的变化规律，有望能为进一步阐明HIBD后脑水肿的病理生理机制提供实验依据，并为临床治疗提供新思路。本文通过对新生鼠HIBD模型AQP9与脑水肿关系的研究旨在为今后治疗脑水肿开辟新的途径。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物 200906/08取健康7日龄SD新生大鼠共40只，体质量在12～18 g，雌雄不限，由哈尔滨医科大学附属二院动物中心提供(动物合格证号：黑动字DT00102008)。采用随机数字表法分为对照组和HIBD模型组各20只。所有动物均按照国家实验动物饲养和使用指南，动物饲养在实验室，室温稳定在20 ℃，12 h明暗交替。

　　1.2 标本取材实验材料及设备 外科手术器械一套，操作台，绑鼠板，无影灯，台灯(60 W白炽灯)，显微镜，氮氧混合气(其中含92% N2，8% O2)，自制缺氧箱，测氧仪。

　　1.3 主要仪器及试剂 AQP9抗体:sc20812，santa cruz(北京中山生物有限公司)，RNA提取:Trizol(上海生物技术公司)，组织蛋白PIERCE:TPER(78510)MemPER(89826)。MMLV逆转录试剂盒:Promega Cat#A3500(100个反应)。

　　AQP9引物上游序列:5′TTG GAC CAT CAT AGG CGC3′，下游序列:5′GCA TGT GAT CGA CAT TGA CC3′，扩增片段长698 bp，TRIZOL Reagent(美国Invitrogen公司)，0.2 mL PCR管，0.5、1.5 mL离心管，10、200、1 000 μL吸头(美国Axygen公司)3 mL匀浆器，氯仿(三氯甲烷)，异丙醇，75%无水乙醇(DEPC水配制)。

　　核酸蛋白检测仪(德国Eppendorf公司)，Himac CF16RX低温冷冻高速离心机(日本HITACHI公司)，Gilson和Dragon微量加样枪0.2～1 000 μL，荧光定量PCR仪LightCycler 2.0(德国Roche公司)，超纯水系统(Sartofus公司，德国)，垂直电泳和转膜系统(BioRad公司，美国)，恒温循环水浴箱，电子天平(Sartorius公司，德国)，Forma -80 ℃低温冰箱(Forma公司，美国)，西门子-20 ℃冰箱(sietnens公司，德国)，Eppendorf5415D微型离心机(Eppendorf公司，德国)，Vortex2振荡器(sI公司，美国)。

　　1.4 实验方法

　　1.4.1 HIBD动物模型的建立 新生鼠乙醚吸入作为基础麻醉，消毒皮肤，2%盐酸普鲁卡因颈部局部麻醉;切开皮肤及皮下组织，分离左侧颈总动脉，并用70号灭菌丝线双线结扎;置鼠于常氧空气中30 min后，放进含8% O2和92% N2混合气体的低氧舱，流量为2 L/min，处理3 h，环境温度为34 ℃，湿度为85%，低氧处理结束后的新生鼠放回含常氧的母鼠笼中饲养1 h，模型建成;对照组仅行假手术，不予颈总动脉结扎和缺氧。两组均于HIBD模型制成后6、24、48、72 h分别处死动物(各时间点动物5只)，断头取新生鼠左脑，置于液氮中保存。

　　1.4.2 RTPCR分析(实时定量PCR)

　　1.4.2.1 总RNA的提取 应用Invitrogen公司Trizol总RNA提取试剂，按说明书提供的方法分别提取细胞总RNA。

　　1.4.2.2 cDNA第一链的合成 配置RT Mix，取上述cDNA为模版进行RTPCR扩增。

　　1.4.3 WesternBlot

　　1.4.3.1 蛋白质提取 将转染48 h的组织细胞取出，用预冷的PBS冲洗3次，以洗净细胞表面上沾有的血清中的蛋白成分;加入裂解液，将细胞从平皿上消化下来，转入1.5 mL无菌管中(冰上操作);剧烈震荡30 s，摇动30 min，13 000 r/min离心15 min，均在4 ℃进行;取上清至新的1.5 mL无菌管中，作好标记。

　　1.4.3.2 电泳 预先制备好12% SDSPAGE胶(SDS变性胶蛋白电泳)，将待测样品加入4×上样缓冲液，混匀，加热煮沸5 min;立即放于冰上，待完全冷却后上样，70 V恒压电泳约6 h。

　　1.4.3.3 Western blot分析(免役印记) 转膜:剪切1张与凝胶大小一致的PVDF膜，两张四边略小于凝胶的Whatman 3号定性滤纸，作好标记后，将其浸泡于去离子水中，待完全湿透后，浸于转移缓冲液中30 min;然后，按一定顺序将其安放于湿转装置中，顺序为:阳极、1张Whatman 3号定性滤纸、PVDF膜、凝胶、1张Whatman 3号定性滤纸、阴极，加入适量转移缓冲液，250 mA恒压转移1 h。

　　封闭:转移结束后，将已作好标记的PVDF膜放入杂交盒中，用0.1% TBST液洗膜20 min，然后加入5%脱脂奶粉的TBST液，室温封闭1 h。

　　杂交:用TBST液洗膜3次，第一次10 min，后两次5 min/次，其间更换洗膜液;加入稀释的一抗，4 ℃杂交过夜;TBST液洗膜3次，10 min/次，加入稀释的HRP标记的二抗，室温下杂交1 h，再用TBST液洗膜3次，10 min/次。

　　ECL试剂盒检测:将杂交后的膜淋干残液，置于一块干净的保鲜膜上，蛋白面向上;将按比例混和好的ECL A/B液加到膜面上，使其在膜表面均匀铺展，室温避光显色1 min;然后，用保鲜膜包好杂交膜，排出气泡，将蛋白面向上放入暗盒中，在暗室中压片、自显影、洗片。

　　抗体的再杂交:将膜放入TBST液中，室温洗膜20 min，将其浸入55 ℃预热的Strip buffer中30 min;随后用TBST液室温洗膜30 min，5%脱脂奶粉的TBST液，封闭1 h;加入一抗室温杂交1 h，TBST液洗膜3次，10 min/次;加入稀释的HRP标记的二抗，室温下杂交1 h，再用TBST液洗膜3次，ECL检测同上。

　　1.5 统计学方法 采用SPSS 11.0统计软件进行数据分析，进行两样本均数比较的t检验，P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 RTPCR结果 见表1。

　　表1 不同时间点缺血缺氧脑组织中AQP9基因RTPCR表达变化(±s，n=20)注：与对照组比较，aP&<0.05;与6 h比较，bP&<0.05。

　　不同时间点脑组织AQP9基因水平，对照组与HIBD组相比较，差异具有统计学意义(P&<0.05)，提示脑组织AQP9基因水平表达在缺氧缺血6 h后就开始升高，24～48 h逐渐升高，表达加快，随后上升至72 h达到高峰。在脑组织中AQP9蛋白表达与脑含水量的变化呈正相关。

　　2.2 Western blot结果 见表2。表2 不同时间缺血缺氧脑组织中AQP9蛋白Western blot结果(±s，n=20)注：与对照组比较，aP&<0.05;与6 h比较，bP&<0.01。

　　不同时间点对照组与HIBD组相比较，差异具有统计学意义(P&<0.01)，提示脑组织AQP9蛋白水平表达在缺氧缺血6 h后就开始升高，24～48 h逐渐升高，表达加快，随后上升至72 h达到高峰，并高于对照组。

　　3 讨论

　　AQP是一种水通道，能增加膜对水的通透性，目前发现水通道蛋白AQP9在脑组织中分布广泛，含量丰富，可能参与了脑组织水的运输平衡调节。以往动物实验证明，在缺氧缺血性脑水肿过程中，水通道蛋白9的表达上调可能是其中一个重要环节，这种发现可能将为缺氧缺血性脑水肿新的临床治疗方案提供有利的理论依据，对揭示缺氧缺血性脑水肿的发病机制意义重大。

　　随着研究的不断深入，AQP9在缺氧缺血性脑水肿形成中的作用引起人们广泛关注。Elkjaer等[2]通过阻塞鼠大脑中动脉进行缺血再灌注的研究发现，再灌注后梗死灶周围星胶质细胞AQP9的免疫标记，明显增强，在实验性脑创伤性损伤后，AQP9在损伤侧的表达上调，而且与脑水肿的严重程度正相关[3]。以上研究提示AQP9的过度表达与脑水肿的形成密切相关，但对其缺氧缺血性脑水肿发生发展过程中变化规律及与脑水肿病理变化的关系，尚缺乏系统的研究。

　　本研究通过新生鼠试验，建立新生鼠脑缺氧缺血性脑水肿模型，来研究AQP9的表达规律，研究结果显示:AQP9在缺氧缺血性脑水肿形成中表达为动态变化过程，脑缺血6 h后AQP9 mRNA和蛋白质开始升高，AQP9 mRNA由15.49上升到16.00，AQP9蛋白值由0.821上升到0.923，随着缺血时间延长，AQP9 mRNA和AQP9蛋白的表达同时增加，24～48 h AQP9 mRNA表达明显加强，其上升趋势持续到72 h达到高峰AQP9 mRNA值为16.83，与此同时，AQP9蛋白上升到1.315，在缺氧缺血性脑水肿发展过程中，AQP9 mRNA和AQP9蛋白的表达呈正相关，在大脑中动脉闭塞所致缺血性脑水肿模型中，研究显示在第3天，位于皮质梗死周围的分子层和外颗粒层可见AQP9 mRNA表达增强[4]，本实验结果在第3、7天AQP9 mRNA明显增强以后逐渐回落，持续7 d仍比较高，此期正是细胞水肿占主导地位的病理阶段，这与Badaut等实验中观察到的结果基本一致:研究发现梗死灶周围，主要是皮质、苍白球、杏仁核的星形胶质细胞上AQP9免疫标记增强，被证实可以清除细胞外大量乳酸和尿素[5]，在实验性脑创伤损伤后，可导致细胞能量产生障碍，AQP9在损伤侧表达增强，而且与脑水肿严重程度呈正相关，进一步证实了AQP9表达增强是形成脑细胞水肿的关键因素，说明脑缺氧缺血性脑水肿的发生发展与AQP9的过度表达有密切关系[6]，而且AQP9表达与脑缺氧缺血程度呈正相关。

　　以往研究证实，AQP9在生理条件下，可协助清除体内乳酸盐，并可通过“乳酸穿梭”机制将乳酸从星形胶质细胞向神经元传递，作为神经元能量代谢的补充物质，当pH值降低到5.5时，AQP9对乳酸盐的通透性可提高4倍，同时伴随着水分子的大量转运，由此推测脑缺血引起乳酸酸中毒可能导致AQP9表达异常上调，促进脑水肿的发生发展[7]。

　　研究结果提示AQP9表达增强可能是脑水肿产生的分子机制之一，由此推测缺氧缺血性脑水肿发生机制可能为:脑缺氧缺血所致Na+K+ATP酶活性下降，使细胞内外渗透压失衡，激活了细胞膜外的渗透压感受器，导致了AQP9基因表达增强，细胞膜结构发生改变，增加了细胞膜对水的通透性，导致水通道开放，大量水分子和Na+离子流入细胞内，形成细胞内水肿，同时K+离子外流增加，致使神经细胞膜去极化，钙通道开放，大量钙离子流入细胞内，引起钙超载，激活相应的受体，使神经细胞的蛋白质和磷脂代谢紊乱，导致严重的细胞毒性脑水肿[8]。

　　由此，可以推断AQP9表达上调可能是缺氧缺血性脑水肿病理损伤的重要分子机制之一。因此，如能在脑水肿形成早期及时改善脑组织血氧供应，控制AQP9过度表达，将有利于减轻脑水肿程度，在基因水平上通过抑制AQP9的表达可能为缺氧缺血性脑水肿提供新的治疗方法，成为治疗脑水肿的新突破。

参考文献

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　　[2] Elkjaer M，Vajda Z，Nejsum LN，et al.Immunolocalization of AQP9 in liver，epididymis，testis，spleen，and brain[J].Biochem Biophys Res Commun，2000，276(3):11181128.

　　[3] Fukui S，Fazzina G，Amorini AM，et al.Differential effects of atrial natriuretic peptide on the brain water and sodium after experimental cortical contusion in the rat[J].J Cereb Blood Flow Metab，2003，23(10):12121218.

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　　[7] 骆世芳，孙善全.AQP9在组织中的分布和功能[J].解剖科学进展，2004，10(3):253256.

　　[8] 李燕华，李瑶宣，李吕力，等，脑缺血大鼠水通道蛋白9 mRNA表达与钙离子浓度的改变及其关系[J].临床神经病学杂志，2008，21(2):129132.