HPLC法流动相选择及相浓度比例对头孢克肟分散片含量测定分析

　　　　　　 作者：曾荣华，卢慧娴，邓雪媚

【摘要】 　　目的：建立高效液相色谱法测定头孢克肟分散片的含量及有关物质的方法。方法：色谱柱：Luna C18(250mm×4.6mm，5μm)，四丁基氢氧化铵溶液∶乙腈(70∶30)为流动相，检测波长为254nm。流速1.0mL／min，进样量：10μL，柱温：40℃。结果：头孢克肟在进样量25～300mg/ L的范围内，线性关系良好；回归方程：Y=3.65×104X-1.25×104，r=0.9998。有关物质在进样量150～1500mg/ L的范围内线性关系良好；回归方程：Y=578×103X-36×103，r=0.9998。结论：本法试剂易得，样品处理简便，分析快速准确，重现性好，可以作为头孢克肟分散片的含量及有关物质测定方法。

【关键词】 头孢克肟；分散片；高效液相色谱法；含量

　　［ABSTRACT］ Objective: To establish an high performance liquid chromatography (HPLC) for quantitative determination of dispersible tablets and related substances. Methods：Cefixime was separated on ODS column with mobile phase of tetrabutylammonium hydroxide solution：acetonitrile (70:30) and detected at pulse detection of 254 nm. The flow rate was 1.0 mL/min， and the column temperature was 40℃; Injection volume was 10 μL. Results: The standard curve was linear within the range of 25～300 mg/ L and the regression equation was: Y=3.65×104X1.25×104 r= 0.9998 in cefixime. The standard curve was linear within the range of 150～1500 mg/ L and the regression equation was Y=578×103X36×103 and r= 0.9998 in the related substances. Conclusions：The above mentioned method is simple，rapid，accurate，and reliable， thus can be used for quantitative determination of dispersible tablets and related substances.
　　
　　［KEY WORDS］ Cefixime; Dispersible tablets; High performance liquid chromatography (HPLC); related substances; Concentration

　　头孢克肟(cefixime) 为β内酰胺类的抗生素，是第3代广谱口服头孢菌素，对革兰阳性菌和革兰阴性菌均有抗菌活性。《USP》29版和《BP》2004年版均已收载本品。具有抗菌谱广、半衰期长、用药剂量小、适应证广，疗效好、不良反应轻等突出特点［1］。对多种致病菌有较强的抗菌活性和良好的药代动力学特征，治疗下呼吸道感染有显著疗效［2］。且因其对胃酸稳定，可以口服给药，患者依从性好，可以作为一个较好的抗感染治疗的转换用药［3，4］。头孢克肟制剂中降解产物较多，加上其他辅料的干扰，使用紫外法进行含量测定并不恰当。本实验采用高效液相色谱法测定头孢克肟分散片含量及有关物质，实验结果表明，本法操作简便，重现性好，结果准确可靠。现报道如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 仪器与试剂
　　
　　惠普Agilentl100高效液相色谱仪，Agilentl100型紫外检测器，LC20AT智能泵，北京塞多利斯天平有限公司BP211D电子分析天平，北京谱析通用仪器有限公司TU1800SPC型紫外可见分光光度计。10％ 四丁基氢氧化铵(分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司)；甲醇(色谱纯，天津市康科德科技有限公司)；乙腈(色谱纯，天津市康科德科技有限公司。头孢克肟分散片(规格为50 mg／片，批号为20080305，20080416，20080503，广州白云山制药有限公司)；头孢克肟对照品(批号为20070202，中国药品生物制品检定所)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 色谱条件与系统适用性试验

　　色谱柱：Luna C18(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：40℃。四丁基氢氧化铵溶液的配制：取10％ 四丁基氢氧化铵溶液25mL用高纯水稀释至1000mL，摇匀，用1.5mol/L磷酸调节pH至7.0。以四丁基氢氧化铵溶液∶乙腈(70∶30)为流动相，流速1.0mL／min，进样量：10μL，检测波长：254nm，理论板数按头孢克肟计算应不低于1500mg。精密称取头孢克肟对照品适量，用水溶解并稀释成每1mL中含头孢克肟100μg的溶液，置95℃水浴中加热45min后冷却，产生头孢克肟异构体。经用选定方法分析，与主峰达到了良好的分离［5，6］。

　　1.2.2 溶液的制备

　　对照品溶液：精密称定头孢克肟对照品，加磷酸缓冲液(取磷酸6.8mL加水稀释至300mL，用10mol/L NaOH调节pH至7.0，加水稀释至1000mL，混匀)溶解并定量稀释成0.2mg/mL的溶液（必要时超声处理使溶解完全）。供试品溶液：取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于头孢克肟40mg)置200mL量瓶中，加磷酸缓冲液适量，于65℃水浴15min，冷却，滤过，取续滤液，作为供试品。称取处方量的空白辅料(除主药头孢克肟以外的成分)，参照2005年版《中国药典(2部)》附录项下干燥恒重试验，得到空白对照品，按供试品溶液制备方法制备，作为阴性对照品溶液。有关物质：参照供试液的制备，制成含头孢克肟1.0mg／mL的溶液。

　　2 结果

　　2.1 标准曲线的制备

　　2.1.1 含量测定标准曲线

　　取头孢克肟对照品适量，然后磷酸缓冲液使溶解，再分别定量稀释成10，25，50，100，200mg/L 5种浓度的标准工作液，分别取20μL进样，各浓度进样3次，以浓度对峰面积进行线性回归。回归方程：Y=3.65×104X-1.25×104，r=0.9998。结果表明，头孢克肟在进样量25～300mg/L的范围内，峰面积与进样量之间呈良好的线性关系。

　　2.1.2 有关物质检查标准曲线

　　取头孢克肟对照品适量，然后磷酸缓冲液使溶解，再分别定量稀释成100，200，300，400，500mg/L 5种浓度的标准工作液，分别取20μL进样，各浓度进样3次，以浓度对峰面积进行线性回归。回归方程：Y=578×103X-36×103，r=0.9998。结果表明，头孢克肟在进样量150～1500mg/L的范围内，峰面积与进样量之间呈良好的线性关系。

　　2.2 回收率试验
　　
　　配制0.16，0.20，0.24mg/mL 3个不同浓度的溶液各3份，混匀。按照“1.2.2”项下制备对照品溶液，分别精密量取此液及对照品溶液各10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，求得平均回收率(n=9)。辅料对测定均无干扰。结果见表1。表1 回收率与精密度测定结果（略）

　　2.3 样品的测定
　　
　　取本品研细，精密称取适量(约相当于头孢克肟25mg)置25mL量瓶中，加磷酸缓冲液适量，振摇使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。照“2.1.1”项下的方法测定，结果见表2。表2 样品含量测定（略）

　　3 讨论
　　
　　查阅有关资料，头孢克肟含量测定有紫外分光光度法和高效液相色谱法，笔者对2种方法均进行了测定，通过比较，高效液相色谱法效果更好。流动相的选择《USP》29版和《BP》2004年版，均采用四丁基氢氧化铵与乙腈系统进行色谱分离，但是四丁基氢氧化铵的浓度较高，系统不容易稳定而且分离效果不好。试验比较了水相∶有机相为5∶2；水相∶有机相为775∶225；水相∶有机相为2∶1三组流动相。结果表明，流动相为四丁基氢氧化铵溶液(取10％ 四丁基氢氧化铵溶液25mL用高纯水稀释至1000mL，摇匀，用1.5mol/L磷酸调节pH至7.0)∶乙腈(70∶30)最佳，且本法离子对试剂四丁基氢氧化铵用量较少。头孢克肟样品的甲醇和磷酸盐缓冲溶液在紫外/可见光分光光度计上于190～400nm间扫描，在288nm处有最大吸收峰，但因中国药典头孢类药物质量标准中含量测定时检测波长多选择254nm，且《USP》29版和《BP》2004年版亦选择254nm作为HPLC测定波长，同时我们通过实验发现，选择254nm作为检测波长亦可检出各个杂质，同时获得较大的线性范围，可一次进样完成含量和有关物质的同时测定。使用254nm作为头孢克肟含量测定的波长，灵敏度更高，测定结果更稳定、可靠，与文献报道一致［7］。
　　
　　本文建立的测定头孢克肟胶囊分散片及有关物质的高效液相色谱分析方法，分析时间短，峰形窄且无拖尾现象，理论塔板数较高，具有分析快速准确的特点，且操作简便，所需试剂易得，适用于头孢克肟的制剂生产的质量控制。曾荣华等.HPLC法流动相选择及相浓度比例对头孢克肟分散片含量测定分析

参考文献

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　　2 房玉环. 头孢菌素序贯治疗细菌性下呼吸道感染的成本效果分析［J］. 齐齐哈尔医学院学报， 2008，29(11): 13181319.

　　3 李小荣. 口服头孢克肟用于转换治疗的国内现状［J］．中国抗生素杂志， 2008，33(8): 506508.

　　4 车薇，张韶峰，王红，等. 头孢克肟临床治疗呼吸道细菌感染疗效评价［J］．中华医院感染学杂志， 2008， 18(7): 1017.

　　5 杜旭，冯涌，曹晓云，等.高效液相色谱法测定头孢克肟及其片剂和胶囊剂的含量和有关物质［J］.天津药学，2009，21(3):2729.

　　6 毕津莲，李湘斌. 高效液相色谱法测定头孢克肟胶囊的含量［J］. 中国现代医学杂志， 2008，20(21): 32143216.

　　7 沈健，周建国. 高效液相色谱法测定头孢克肟分散片的含量［J］. 中国药业， 2008，17( 14): 43.