作者：黄忠仕，张树球，农嵩，李韬，李曙波
【摘要】 目的 确定二苯乙烯苷含药血清作用于老年性痴呆(AD)细胞模型的最佳条件。方法 利用细胞计数、MTT方法确立β淀粉样蛋白(Aβ)25-35片段在建立AD细胞模型时的浓度及筛选二苯乙烯苷含药血清作用的最佳浓度，分别观察不同浓度血清及不同浓度Aβ25-35对AD细胞模型存活率的影响。结果 各种血清以5%浓度组的细胞存活率最高。在5%血清浓度下，Aβ25-35 0μmol/L和5μmol/L浓度组中各含药血清组细胞存活率均明显高于正常大鼠血清组(P&<0.05或P&<0.01)，但在10μmol/L Aβ25-35浓度时差异无显著性。结论 选用5μmol/L Aβ25-35及5%血清浓度建立NG108-15 AD细胞模型及药效考察体系较为合适，在此条件下能客观地评价二苯乙烯苷含药血清的药效。
【关键词】 二苯乙烯苷 痴呆 老年性 β淀粉样蛋白 NG108-15细胞
Abstract: Objective To confirm the optimum conditions of TSG-containing serum affect on cell model of Alzheimer's disease (AD). Methods Cell counting and MTT technique were used to determine the optimum concentration of amyloid β25-35(Aβ25-35) and drug-containing serum in establishing cell model of AD， then observed the cell survival rate of the cell model after treated with different concentration of rat's serum and of amyloid β25-35， respectively. Results 5% concentration of serum resulted in the highest cell survival rate among all kinds of serum. At the 5% concentration of serum condition， the cell survival rate of drug-containing serum groups were higher than the normal serum group at 0μmol/L and 5μmol/L concentration of Aβ25-35 (P&<0.05 or P&<0.01)， but had no difference at 10μoml/L concentration. Conclusions It is the optimum condition to select 5μmol/L concentration of Aβ25-35 and 5% concentration of drug-containing serum to establish the NG108-15 cell model of AD and the best system to assess the drug efficacy. Under these conditions can be objectively assessed the drug efficacy of TSG-containing serum.
Key words: 2，3，5，4'-tetrahydroxy-stilbene-2-O-B-D-glycoside; dementia， senile; amyloid beta-protein; NG108-15 cells
用动物模型研究老年性痴呆（AD）能够反映整体水平的变化以及行为和记忆功能的改变，但由于体内复杂因素的影响，对某些特殊类型细胞功能及细胞结构、酶、离子及其通道、受体的研究却较困难。动物细胞的体外培养成功弥补了这一缺陷。利用细胞培养法建立AD细胞模型已经成为现代生物医学研究AD的重要手段［1，2］。我们将β淀粉样蛋白(Aβ)25-35作用于NG108-15神经细胞，建立AD细胞模型，研究二苯乙烯苷（2， 3， 5， 4′-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glycoside， TSG）含药血清对AD细胞模型的影响。本实验主要探讨建立AD细胞模型的Aβ25-35的最佳浓度和二苯乙烯苷含药血清的最佳作用浓度，观察在不同浓度Aβ25-35和不同浓度二苯乙烯苷含药血清的细胞存活率。现报道如下：
1 材料
1.1 动物
健康3月龄Wistar大鼠60只，雌雄兼用，体重200～250g，由广西医科大学实验动物中心提供（许可证号：SCXKG桂2003-0003，实验动物使用许可证：SYKG桂2003-0005）。
1.2 主要药品与试剂
二苯乙烯苷：由本教研室根据有关文献［3，4］提取；石杉碱甲（豫中制药厂生产，批号：H10940156）；Aβ25-35片段，环磷酸腺苷(cAMP)，青霉素(Penicillin) G，硫酸链霉素，MTT（以上试剂由Sigma公司提供）；HAT（次黄嘌呤/胸腺嘧啶核苷/氨甲喋呤，Gibco 公司提供）；胎牛血清（FBS），DMEM培养基（由Hyclone公司提供）。
1.3 主要仪器
CO2培养箱（Thermo Forma公司），倒置显微镜（南京江南光电股份有限公司），酶标仪（Metertech公司）。
1.4 实验细胞株
NG108-15细胞：由广西中医学院钟振国教授惠赠。
2 方法
2.1 含药血清的制备及实验血清浓度的选择
将健康的3月龄Wistar大鼠60只，随机分为3组，每组20只：①正常对照组；②石杉碱甲组；③二苯乙烯苷组。各组根据成人治疗量换算为大鼠用量，用高剂量灌胃。每天灌胃量0.5ml/100g体重，二苯乙烯苷按0.3g/kg体重，石杉碱甲按0.02mg/kg体重，正常血清组给相应体积的生理盐水，每天1次，连续灌胃10天，于末次给药后2h，用20%乌拉坦腹腔麻醉，腹主动脉抽血，离心分离血清，56℃灭活30min，无菌过滤，即得相应的含药血清。将各组含药血清和正常对照组血清分别加入HAT、双抗和DMEM培养液，配成含5%、10%、20%的含药血清和正常对照组血清DMEM培养液（各组HAT和双抗的终浓度均为1%），培养NG108-15细胞，以生存率为指标，选择细胞生长状态最好的血清浓度为实验血清浓度。
2.2 Aβ25-35浓度的选择
将Aβ25-35溶于高压灭菌后的生理盐水，配成250μmol/L母液备用。在筛选出最佳实验血清浓度的基础上，分别比较大鼠血清在Aβ25-35 0μmol/L、5μmol/L和10μmol/L浓度时的细胞生存率，确立Aβ25-35片段在建立细胞模型时的最佳浓度。
2.3 AD细胞模型的建立
将NG108-15细胞加入细胞增殖液（5%FBS加DMEM加1%HAT加1%双抗），在10%CO2、37℃条件下培养1天，然后加入较适浓度Aβ25-35片段，继续培养1天后，即建成AD细胞模型。以各含药血清或含正常对照组血清DMEM培养液更换原培养液，仍加入上述较适浓度Aβ25-35片段以维持AD细胞模型。培养2天后进行观察、分析。
2.4 细胞存活率观察
细胞直接置于光学显微镜下观察其形态及计数其存活率。在培养板每孔上下左右中5个视野各拍片1张，然后在照片上计算培养板各组细胞的数目，将最初播下的细胞数定为基数（100%），然后将各组细胞与原播种细胞数相比得出各组结果。
2.5 MTT测定法
吸弃待测细胞培养孔内培养液，加无血清DMEM液100μl/孔，MTT液20μl，置于37℃、10%CO2条件下4h，出现蓝色结晶后，加SDS-DMF100μl/孔，于37℃、10%CO2条件下过夜，用酶标仪于λ=570nm处测OD值。
2.6 统计方法
所有检测结果以(±s)表示。用SPSS 10.0统计软件分析，多组间均数比较采用方差分析，两组间均数比较采用t检验，显著性水平设在α=0.05。