【关键词】 Notch信号;心脏发育
细胞发育受到自身或外在的、近程或远程的信号调控，其中细胞之间的相互通讯在细胞发育中扮演重要角色[1]。在调控细胞发育的若干信号通路中，Notch是相邻细胞之间互相通讯进而调控细胞发育的典型信号通路，并且越来越多的证据表明Notch信号介导的细胞间通讯在心脏发育过程中起重要作用，Notch信号通路的突变会导致小鼠和人类心脏发育异常。现将Notch信号通路与心脏发育的关系综述如下。
1 Notch信号通路的分子组成
Notch信号通路的构成：完整的Notch信号通路由Notch受体、Notch配体和细胞内效应分子CSL(CBF1、Suppressor of Hairless、Lag-1)，而CBF1、Suppressor of Hairless、Lag-1是这个蛋白在哺乳动物、果蝇、线虫的不同名称)DNA结合蛋白等效应物、Notch的调节分子等组成。
1.1 Notch受体是一个相对分子量为30000的Ⅰ型膜蛋白，大约由2500个氨基酸组成，羟基端在细胞质内，氨基端在细胞外。根据与细胞膜的关系大体上可分为胞外区、跨膜区、胞内区(Notch intracellular domain，NICD)三部分。胞外区和NICD均高度保守。胞外区包含一组串联排列的表皮生长因子样重复序列(epidermal growth factor-like repeats，EGFR)和3个Lin/Notch重复序列。EGFR在Notch受体和配体结合中起关键作用，在果蝇中Notch受体的第11位和12位EGFR介导了其与配体结合。在哺乳动物细胞中，已经发现4种受体(Notch1-4)，其区别主要是EGFR重复序列。这些基因的表达遍及胚胎发育过程的各个组织，以及成熟组织中具有增殖能力的细胞层。跨膜亚基包括跨膜区、RAM序列、CDC10/锚蛋白重复序列、NCR(Notch Cytokine Response region)、PEST、多聚谷氨酰胺序列等结构域。CDC10/锚蛋白重复序列是Notch分子中最保守和最基本的结构域，它不仅与其他蛋白分子直接作用，还具有反式激动功能。NCR结构域具有细胞因子特异性。PEST结构域与蛋白降解有关[2]。果蝇Notch和哺乳动物Notch1-3还有核定位信号和OPA序列。
1.2 Notch配体与受体一样为Ⅰ型跨膜蛋白。果蝇Notch配体有2个同源物Delta和Serrate，线虫的Notch配体为Lag2， 故又称Notch配体为DSL蛋白。脊椎动物体内也发现了多个Notch配体，与Delta同源性高的称为Delta样分子，与Serate同源性高的被称为Jagged。目前，发现人类的Notch配体有Delta-like 1、3、4和Jagged 1、2配体， DSL结构域在进化中高度保守，是配体与受体结合、激活Notch信号所必需的[3]。这些配体均是单次跨膜糖蛋白，其胞外区含有数量不等的EGFR样重复序区，N端由一个结合Notch受体所必需的DSL基序，Notch配体的胞内域较短，只有70-215个氨基酸残基，功能目前不清楚。近年来研究发现，Delta1的胞内域能够诱导细胞的生长抑制。
1.3 细胞内效应分子CSL DNA结合蛋白CSL蛋白是一种DNA结合蛋白，是Notch信号通路中关键的转录调节因子。CSL是脊椎动物中的CBF1、果蝇中的Su(H)及线虫中的Lag-1等转录因子的缩写，作为Notch信号通路中的初级效应分子，NICD进入细胞核后，其Rel同源区N端的B折叠结构域与Notch的活化形式NICD结合形成NICD-CSL复合体，此复合体再通过CSL分子的RHR及其N端的32-435位氨基酸残基与GTGC～AA序列结合，进而激活靶基因的表达[4]。研究表明Notch信号的靶基因多为碱性螺旋-环-螺旋类转录因子(basic helix-loop-helix，bHLH)，如哺乳动物中的HES(hairy/enhancer of split)、果蝇中的E(spl)(enhancer of split)等[5]。
2 Notch信号通路
Notch信号转导过程的特点是不需要第二信使和蛋白激酶的参与，就可直接接受临近细胞的信号并传到细胞核，激活相关转录因子的表达，这种传导方式虽放大效率低，但特异性强，可基本避免其他信号的干扰。Notch配体与受体结合后，在TACE(Tumor necrosis factor α-converting enzyme，TACE)作用下，Notch受体于细胞膜外被酶切，释放出和Notch配体连接的胞外部分J。随后在y一分泌酶的作用下，胞内段被酶切，形成可溶性的NICD转移至核内，通过激活转录因子CLS而调节基因表达。CSL作为Notch信号通路的初级效应分子，通过其N端的B折叠结构域与NICD结合形成NICD-CSL复合体后，再通过N端的31-435位氨基酸残基与GTGGGAA序列结合，进而激活靶基因的表达。Notch信号的靶基因多为bHLH家族转录因子，如较常见的HES。近年来又发现另一类不同的bHLH家族分子HERP(HES-related repressor protein，HERP)，其既可形成同型二聚体，也可与HES形成异型二聚体而激活下游基因的表达。Notch信号转导过程的特点是不需要第二信使和蛋白激酶的参与，就可直接接受临近细胞的信号并传到细胞核，激活相关转录因子的表达，这种传导方式并不能放大信号，但对于细胞分化起始过程的精确调控是十分必要的。另一种Notch信号转导途径为非Su(H)/CBF1依赖性。近来报道果蝇Notch结合蛋白deltex是非Su(H)依赖性信号必需的。Notch激活后，deltex不进入细胞核而与是Grb2作用介导Ras-JNK(c-jun N-terminal kinase)途径，如Notch/Delta转导的信号可以抑制Ras和JNK依赖性的bHLH家族转录因子E47的活性[6]。
3 Notch信号与心脏发育的关系
3.1 Notch组件的表达
心脏是第一个开始发生的器官，血管系统的发生则紧随其后，两者组成一个心血管循环系统[7]。心血管系统又是第一个行使功能的系统，其他所有器官的发育和生长都要依靠该系统提供营养和氧气。胚胎时期的循环系统由血管，心脏和造血系统构成 均由中胚层发育来的。中胚层的形成和进化及心室脊的阶段的发育都受到外胚层和内胚层信号通路严密的调节。在小鼠胚胎发育过程中有不同的Notch受体表达，心血管系统中各个受体的表达模式也不尽相同。鼠胚胎第7.5天时，Notchl首先表达于原条阶段中胚层。在小鼠胚胎8.5天，Notch1主要表达于原始心管流出道内膜层，它对原始心管内膜细胞亚类的调节具有重要意义[8];通过对Notch1通路功能缺失突变的研究发现Notch1受体单倍剂量不足导致了主动脉瓣疾病，证明了它在心内膜细胞进入心胶质形成心内膜垫和瓣膜过程中的作用[9]。RBP-J突变的小鼠心内膜垫形成阶段的Delta和Jagged配体的表达显著减少，导致了心瓣膜的发育异常;同时研究发现：斑马鱼心脏内注射构成型活化的NICD刺激了心内膜的有丝分裂，导致了心瓣膜的肥大[10]。研究发现人类基因Notch1表达不足能导致主动脉瓣膜的钙化。Notch4和delta-like 4(Dll4)亦于心内膜中表达，而Notch3直到第13.5天才出现在心房和心室肌中;Notch3在早期头褶阶段表达于生心板中而于第8天消失。第9.5天时，delta-like 1(Dill)出现于心室小梁肌底部心内膜区;而从第12.5天开始，Jaggedl在心室流出道房室区、心房肌和心室小梁肌部均有表达。
通过对小鼠和斑马鱼的Hey基因功能分析发现，Notch信号的靶基因Hey基因的表达模式与Notch大体相仿，证明了在心血管形成过程中Hey基因是Notch信号途径中最明显的转录因子。Heyl和Hey2从心脏发育的早期就一直在心脏中表达。其中，Hey1只在心房表达，而Hey2则在心室表达[11]。在出生前后，Hey1和Hey2在心脏中的表达就逐渐地降低。敲除了Hey1或Hey2的纯合体小鼠依然能够生存并且繁殖后代，可能的原因是Heyl或Hey2功能缺陷可被其他Hey基因部分地弥补。而Hey2的敲除会导致一个大的并延伸到肌性部的膜性室问隔缺损(VSD)，同时伴随双侧心室肥大。在很多情况下，还会出现更复杂的异常，如三尖瓣狭窄或闭锁、肺动脉瓣狭窄、卵圆窝永存或房间隔缺损(ASD)。但是迄今为止，在VSD和Alagille综合征的病人中还没有检测到Hey2编码区的突变[12]。然而Li FB等通过对一Alagille综合征患者研究发现Jag1基因突变，证明了Alagille综合症和Notch信号信号通路相关[13]。
3.2 Notch信号与房室管发育
研究已经证实激活和阻断Notch信号通路均会导致房室管发育异常。研究表明jagged1、hey-2、Hey1/2、 Hey1/L、CSL缺陷及Notch1过渡表达均会导致房室管发育异常[14]。Rutenberg等通过对鸡心脏Notch1和Notch3的研究发现，鸡心脏只表达Notch3 而不表达Notch1。Notch1 的受体jagged1起初只在在心脏管的心肌中表达，但随房室管的发育表达逐渐消失。靶基因hey1在心房心室同时表达，而hey2只在心室表达。这种表达模式说明jag1/2，Notch3， and Hey1/2都参与了调节房室交界区分化。过度表达 Hey1 或 Hey2 可以减少BMP2 在房室管的表达，说明Notch信号通路通过诱导hey基因抑制BMP2表达[15]。Donovan 等研究发现Hey1/ Hey2双突变小鼠会在出生后一周会因严重的心脏缺陷如室间隔缺损、肺动脉狭窄、房室瓣病变及心室肥厚出现死亡率显著增高，Hey1和 Hey2基因联合缺失则会在胚胎发育9.5天时发生严重的心室肌肉变薄和动脉分化异常心脏畸形而导致死亡[16]。
3.3 Notch促进心脏发育中EMT的形成
房室管形成后，在邻近心肌诱导信号刺激下心内膜细胞发生形态学改变，上皮-间叶细胞转化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)，侵入深层的心胶质中形成心内膜垫，并进一步重塑形成瓣膜组织。发育过程中调控EMT发生在心脏发育的的最初阶段。房室管EMT在小鼠胚胎发育9.5天开始房室管的心内膜表达Notch受体1、2、4和配体jagged1 和Dll4，激活Notch通路是诱导房室管EMT所必需的。研究发现Notch1缺乏会导致EMT的发生，Notch还可以通过下游靶基因调节间充质细胞的形态[17]。Notch受体及配体的表达是通过VEGF( Vascular endothelial growth factor)通路调节的。VEGF通路必须在EMT前被Notch的靶基因 Hey2所抑制，hey基因参与调节间充质细胞的形态，部分与调节MMP2(matrix metalloproteinase 2)有关。Notch调节EMT是通过TGFβ通路调节Snail表达和和直接调节snail完成的。当Notch和TGFβ被激活，VEGF通路会抑制，与此同时EMT低下[18]。Notch调节EMT的机制是血管内皮钙粘蛋白在房室管心内膜表达的负向调节[19]。EMT还与转录因子Snail家族密切相关，后者能够下调VE钙黏蛋白的表达。Notchl突变造成Snail和Slug基因表达下降，减弱了对VE钙黏蛋白的抑制作用而导致心内膜垫细胞数量明显下降;Notch信号通路通过Sail家族成员抑制血管内皮钙粘蛋白的表达而启动EMT且不受hey基因影响，而hey基因只参与调节间充质细胞的表型。
3.4 Notch信号与心室发育 心室发育过程中心肌前体细胞分化为外部致密层和内部肌小梁层。在胚胎发育9.5天发现Notchl和Dill4于小梁层底部的心内膜表达[20]，而敲除Notchl大鼠胚胎肌小梁形成缺陷且失去特征标志物表达能力;而Notchl过度表达则导致房室管区出现异位表达的小梁肌。小梁肌的形成需要EphB2及其受体EphB4、神经调节蛋白NRGl及其受体ErbB2，4和BMPl0的共同参与。NRGl、ErbB2或ErbB4缺陷均可能导致胚胎死亡和严重的肌小梁发育障碍;而外源性BMPl0或NRGl能够补救敲除Notchl的心室发育缺陷，证明心内膜Notch信号作为上述基因的上游调节因子在肌小梁发育过程中具有重要作用。Notch主要的靶基因Hey2的功能已经通过该基因敲除小鼠的表现予以证明。该基因缺失的纯合小鼠死于生后的第一周，该小鼠出现了三尖瓣畸形、室间隔缺损和法乐氏四联症，血流动力学分析还显示了左心室功能的下降，并且左心室中检出较多心房组织标志物(ANF、Tbx5、Mlcla/2a)[21];而当Hey2过度表达时，心房标志物表达水平明显下降，这表明hey2 是心房和左心室肌小梁基因表达所必需的。Hey2通过以下两个机制调节肌小梁基因的表达：(1)是hey2直接抑制心房和肌小梁ANF， Cx40积基因的表达;(2)是hey2阻断GATA4/6的表达。
3.5 Notch信号与流出道发育(outflow tract，OFT)
流出道是由次级心脏域，神精脊和心内膜细胞分化而来。当次级心脏域发育成OFT心肌，神精脊衍生细胞迁移到OFT垫，OFT垫把OFT分隔为主动脉和肺动脉[22]。Notch 的受体配体及目标基因的表达在OFT发育中起到多重的作用包括：心脏神精脊细胞分化为主动脉弓的血管平滑肌细胞。在主动脉和主动脉弓发育过程中其内皮表达Notch1和Notch4受限，相反的Notch3和Notch3表达在心脏神精脊及其衍生的主动脉弓的血管平滑肌周围。Jagged1也在主动脉弓周围的血管平滑肌细胞上表达，jagged2 表达更为广泛和jagged1表达有重叠。Dll1只表达在心内膜而主动脉弓内皮细胞没有表达，Dll4在主动脉弓内皮细胞和心内膜都有表达，Dll3 在主动脉或主动脉弓均无表达[23]。当Notch通路被阻断时，诱导血管平滑肌细胞的标记物不会出现，说明Notch与心脏神精脊细胞分化为主动脉弓的血管平滑肌细胞有关。神经嵴含有多种背侧神经管来源的前体细胞，在分化前阻断Notch信号可引起明显的血管平滑肌细胞数量下降，产生肺动脉狭窄和主动脉弓缺陷等类似于Alagille综合征的表型特征。小鼠的hey-2基因缺乏导致心血管畸形包括法四和肺动脉狭窄，也证实了jag-1、Notch3 和hey2 与Alagille综合征有关[24]。
4 展 望
心脏是人体生存和活动不可缺的重要器官，而心脏的发生和发育又是一个非常复杂和精细的调控过程。Notch信号通路在心室肌小梁形成和EMT等心脏发育的过程中起着重要作用。但是其精确的调控具体机制仍不明确，但Notch调控心脏发育的功能已被证实，因此Notch信号通路作为潜在的治疗的靶位基因具有广阔的研究前景及临床意义，对于将来预防及先天性心脏病的发生早期干预及心血管疾病的治疗具有重大的临床意义。
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