作者：刘晓燕，王丽，张志霞，李娟，何涛
【摘要】 目的 建立Twist基因的逆转录聚合酶链式反应(Reverse tran scription polymerase chain reaction，RT-PCR)条件，为探讨Twist功能学研究奠定方法学基础。方法 根据Genebank中的Twist(NM_000474)基因序列设计引物，以GAPDH为内参照基因(NM_002046)，用RNA simple Total RNA kit提取培养的肾癌细胞总RNA，按照Quantscript RT kit Quant cDNA第一链合成试剂盒说明书合成cDNA，PCR扩增操作按照TAKARA公司的LA Taq with GC Buffer PCR试剂盒说明书，设置PCR反应体系并优化扩增反应条件，琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。结果 采用TAKARA的LA Taq with GC buffer PCR试剂盒并通过PCR扩增条件的优化，成功建立了Twist基因的RT-PCR方法，在肾癌细胞系786-0中扩增出大小为150bp左右清晰的目的条带。结论 成功摸索出了具有复杂二级结构、富含GC的Twist基因的RT-PCR扩增方法，并证明在肾癌细胞系786-0中存在Twist基因的特异性表达。
【关键词】 肿瘤;Twist基因;RT-PCR
The Setup of RT-PCR for Twist Gene in Tumor Cells
Liu Xiaoyan，Wang Li， Zhang Zhixia， Li Juan， He Tao， Laboratory of Molecular Biology， Luzhou Medical College， Luzhou City， Sichuan Province 646000， P. R. China
Abstract Objective To set up the reverse transcription polymerase chain (RT-PCR) method for detecting Twist expression in case to make further researches on its structure and function.Methods According to the human Twist gen sequence available in Genbank， a pair of primers was designed and the standardization was calibrated by GAPDH gene as an internal control; total RNA of renal carcinoma cell line 786-0 was extracted by simple total RNA kit and the first chain of cDNA was composed in accordance with the instruction of Quantscript RT kit Quant cDNA; after the optimization of the amplifying reaction conditions， PCR was processed according to the illustration of LA Taq with GC buffer PCR kit and the amplifying product was identified with agarose gel electrophoresis.Conclusions Twist gene， consisted of 150 nucleotides， was specifically amplified in renal carcinoma cell line.Conclusions The method for detecting human Twist gene with RT-PCR was successfully set up and the target gene was expressed specifically in renal carcinoma cell line 786-0.
KEYWORDS tumor Twist gene RT-PCR
Twist是胚胎发育相关基因，编码一种在胚胎发育中起关键调控作用的转录因子，在诱导细胞移动及组织塑型中起重要作用[1]。新近发现Twist具有癌基因的特征，在人类肿瘤的发生、发展、愈后、复发中具有重要作用，在人类多种恶性肿瘤中高表达，在正常组织和恶性程度低的癌细胞中无或极低表达[2]。Twist基因GC含量高(75%)，局部区域GC含量可高达90%以上，具有复杂的二级结构，故其RT-PCR方法的建立相当困难。本研究以肾癌细胞系786-0为研究对象，建立Twist基因的RT-PCR方法，为探讨Twist在肿瘤尤其在肾癌中的作用机制奠定方法学基础。
1 材料与方法
1.1 材料 人肾癌细胞株786-0(本实验室保存); RPMI-1640培养基、胎牛血清(Gibco公司);小牛血清(Hyclone公司);RNA simple Total RNA kit总RNA提取试剂盒、Quantscript RT Kit cDNA 第一链合成试剂盒(TIANGEN公司);LA Taq with GC Buffer PCR试剂盒、600bp DNA Marker与2000bp DNA Marker(TAKARA公司);其它所用试剂均为国产或进口分析纯。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 取人肾癌细胞株786-0，复苏后接种于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中，于37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中培养，细胞呈单层贴壁生长后每2d换液1次，生长密度达90%时用0.25 %的胰酶消化传代。
1.2.2 RT-PCR法检测Twist基因mRNA的表达
1.2.2.1 细胞总RNA的提取 取生长密度达90%以上的细胞，弃培养液，0.1%灭菌DEPC水冲洗两次后，按1 ml RZ /10cm2比例加入裂解液RZ，吹打数次使细胞充分裂解，余下的操作按照RNA simple Total RNA kit总RNA提取试剂盒说明书进行。
1.2.2.2 cDNA的合成 取1 μg总RNA做模板，按照逆转录试剂盒说明书进行cDNA的合成。
1.2.2.3 PCR反应 取cDNA产物2(l按照LA Taq with GC Buffer PCR试剂盒说明书配制25(l反应体系，设计三种方案进行PCR反应(基因对应的引物序列、产物大小和PCR反应条件优化方案详见表1)，扩增产物2.5%琼脂糖凝胶电泳后通过凝胶成像分析系统观察和保存图像。表1 PCR反应相关参数
2 结 果
PCR扩增条件方案①中，PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果显示，内参和目的基因各自对应的泳道均存在严重的弥散现象，其中内参泳道对应于DNA Marker 250bp位置上端有一较亮条带，说明GAPDH基因已顺利扩增出，而Twist基因对应的泳道无任何条带。PCR扩增条件方案②中，产物琼脂糖电泳后，GAPDH基因扩增成功，Twist泳道在100bp与200bp DNA Marker条带间有一模糊带，根据分子量大小判断可能为目的基因，在其下端约100bp处还存在一弱带，考虑可能为引物二聚体或其他原因造成的非特异扩增(见图1A)。PCR扩增条件方案③中，产物经琼脂糖电泳后，150bp左右的目的条带清晰锋利，无拖尾和非特异性杂带等现象，表明此方案是扩增条件的最佳选择(见图1B)。图1 人肾癌786-0细胞系中Twist基因的RT-PCR扩增结果
3 讨 论
目前研究表明：Twist在多种上皮细胞癌中过度表达，包括乳腺癌[3]、胃癌[4]、前列腺癌[5]、肝癌[6]等。Twist已被确认是一种癌蛋白，对肿瘤的转移起促进作用。肾癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，具有发病率高、起病隐匿，易转移、生物学行为多变等特点[7]。与其它恶性肿瘤相比，国内外对肾癌的研究较少，尤其对于Twist是否在肾癌细胞或组织中表达的相关报道甚少。因此本研究拟以肾癌细胞株786-0为对象，建立Twist基因的RT-PCR检测技术。在实验过程中，对包括逆转录酶和耐热Taq DAN聚合酶以及PCR反应条件等方面进行了摸索和优化。
Twist基因富含GC，具有复杂二级结构，常规RT试剂盒很难逆转录出有效的cDNA模板，而Quant Reverse Transcriptase逆转录酶具有灵敏度高、较强模版兼容性等特点，可通读GC含量高及二级结构复杂的模版，逆转录出高质量的cDNA。合适的耐热聚合酶的选择是PCR实验中的关键环节，针对Twist基因的结构特殊性，普通的Taq DNA聚合酶很难扩增出目的产物。我们选用多种DNA聚合酶经过反复实验对比，最终采用了TAKARA公司的LA Taq with GC buffer PCR试剂盒，该试剂盒的LA Taq酶混合液结合了Taq 酶的高效性与3'-5'外切酶的矫正耐热活性，与优化的反应缓冲液(该缓冲体系可使LA Taq酶对Mg2+浓度依赖性降低)一起提供了极高的延伸速率和最大程度的聚合保守性。更为重要的是，体系中的GC buffer由于能够破坏模板DNA的二级结构，使得Taq酶能够沿着模板顺利延长，特别适合GC含量高和长片段的扩增。使用该试剂盒，通过对PCR反应条件的优化，最终扩增出了特异的目的基因。
PCR反应参数的优化主要包括循环次数、退火温度、复性时间等。针对Twist扩增中常出现的二聚体和非特异性现象，我们采用逐步提高预变性温度和退火温度最终确定了PCR反应条件，其中将预变性温度时间定在99℃预变性10 min的目的是使变性充分，因变性不完全时，单链GC富集区易于自身配对，形成发夹、环等稳定的二级结构，且DNA双链也会很快复性，影响PCR 反应导致扩增不出产物。之后在温度降到94℃时再冰上加酶，这样既能使模版和引物双链打开，又使酶保持活性。一系列优化实验的结果表明，适当提高预变性和退火温度，是除了设计特异性引物、选择适合条件的逆转录和DNA聚合酶之外，扩增GC含量高，具有复杂结构基因的可行有效办法。
通过以上各方面条件的筛选和优化，最后成功摸索出了扩增GC含量高、结构复杂的Twist基因的RT-PCR实验条件，可用于快速、灵敏、可靠地检测肾癌中Twist mRNA表达。
参考文献
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