作者：邹庆伟，蒲艳，蒲敏，穆东，李波
【关键词】 胆管病;发病机制 ;研究进展
近年来，随着胆管病(Cholangiopathies)[1]发病率的增加，越来越受到国内外学者的关注与探索。作为临床常见的难治性疾病，由于发病机制不清，临床医生只能给予局限的或者对症处理。因此，相关发病机制的研究对临床诊疗胆管病具有重要的现实意义。
1 胆管病(Cholangiopathies)的概述
胆管病是对作用于整个肝内胆管树、以胆管上皮细胞(Biliary Epithe-lium Cells，BEC)为主要攻击靶点的一类疾病的统称，是临床的常见病之一。其本质是胆管树在遭受损伤后异常修复的结果，在这一过程中，弥漫性或者局灶性的胆管树纤维化是关键步骤，也是胆管树损伤、扩张、狭窄及结石形成的病理基础。其病因除了遗传性因素外，还与胆管系统的免疫、感染、缺血、药物毒性、医源性胆管损伤[2]等因素有关。常见的遗传性胆管病如肝囊肿，病因大多数系肝内小胆管发育障碍所致，在这里不再赘述。常见的非遗传性胆管病包括原发性硬化性胆管炎、原发性胆汁性肝硬化、弥漫性肝胆管结石、肝移植术后缺血性胆管病变[3]、自身免疫性胆管病[4]及药物性胆管炎等。目前发病机制不清楚，缺乏特别有效的治疗手段，大部分胆管病患者最终不得不接受肝移植治疗。据统计，在肝移植受者中，儿童高达80%的是胆管病患者，成人这一比例约占20%。即便肝移植成功，每年也约有高达20%的肝移植受者死于肝移植物胆管病。由此可见，对于胆管病的发病机制及治疗机理的研究是摆在医务工作者面前一个亟待解决的一个难题，具有重要的科学意义和现实意义。最近，两个实验室几乎同时报道了一种新的疏水性胆盐(Hydrophobic bile salts，HBS)膜受体(TGR5)[5]在胆管病发病机制中可能起着重要的作用，这将为我们研究胆管病胆管纤维化作用机制提供了全新的视觉和切入点。
2 疏水性胆盐(HBS)与促胆管纤维化的关系
正常成人的胆盐95%以上由疏水性胆盐(HBS)组成，作为胆汁主要成分的HBS是一类具有很强细胞毒性的内源性物质，对细胞具有很强的细胞毒性[6]。 既可以直接损伤细胞生物膜，也可以诱导细胞凋亡，在体内通常以信号分子的形式广泛参与细胞的增值、分化及代谢活动，也是目前已知最强的内源性促胆管纤维化因子。据研究资料表明胆管病的发病过程中均存在疏水性胆盐(HBS)分泌增加或磷脂(Phospholipid，PL)分泌减少为主要表现的比例失衡现象，肝移植实验大鼠早期存在严重的胆汁成分失衡现象[7]，临床病案中也发现了胆汁中的胆盐/磷脂(BS/PL)与肝移植胆管损伤程度呈显著正相关[7]。生理情况下，胆汁内的磷脂(PL)可以中和疏水性胆盐(HBS)细胞毒性作用而保护胆管树，一旦疏水性胆盐(BS)分泌增加或者磷脂(PL)分泌减少，这种保护机制就会遭到破坏，最终形成“毒性胆汁”[6]并造成广泛的胆管树损伤和纤维化，在肝内外胆管结石和胆汁性肝硬化的病例中能观察到这种磷脂匮乏而富含疏水性胆盐的“毒性胆汁”的存在，是导致继发性胆管树损伤及纤维化的主要原因，敲除磷脂转运泵(MDR2)基因的小老鼠(MDR2-/-，在人类的同源基因为MDR3基因)在磷脂完全缺乏的情况会出现由疏水性胆盐(HBS)引起自发的、严重的、弥漫的胆管树纤维化及继发的肝内外胆管结石[8]，进一步研究证实MDR2-/-小鼠的胆管纤维化与TGFβ1、α-SMA等纤维化相关基因表达的改变有关[9]。大量研究资料都已证实了HBS具有极强的细胞毒性，高浓度游离HBS会造成广泛的胆管树损伤及纤维化[10]，HBS在胆管病促胆管纤维化作用中扮演极其重要的作用。
3 胆盐膜受体(TGR5)的生物学作用
胆管病作为临床常见的难治性疾病，作为胆汁主要成分的HBS在胆管病促胆管纤维化作用中扮演重要的角色，传统的观点认为HBS主要通过经典的类法尼醇X受体(Farnes-oid X receptor，FXR)发挥其生物学效应[11]，FXR是一种核激动受体(nuclear hormone receptor，NHR)，是目前发现的最主要的疏水性胆盐内源性受体(其他的一些核激动受体(NHR)，包括SXR和VDR也可以被HBS中的石胆酸(LCA)所激活，但LCA属于次级胆盐、在胆盐池所占比重极低甚至缺乏，目前尚未发现与胆管损伤有关)。经典的FXR介导的通路是：FXR与视黄酸受体(RXR )形成二聚体，疏水性胆盐通过位于胆管细胞(BEC)细胞膜上的胆盐转运蛋白(ASBT)进入细胞核与FXR:RXR二聚体结合，FXR:RXR二聚体再进一步与特定的激素反应元件(IR-1)结合，进而调控靶基因的表达。然而，来自肝细胞的研究证明FXR活化并未表现出任何的促纤维化效应，反而在一定程度上能够延迟纤维化的进程[12]，这说明经典的FXR介导的作用机制难以解释HBS的促纤维化现象。新近发现的胆盐膜受体TGR5可能在HBS的作用机制及其胆管纤维化中扮演重要的角色，这为我们研究胆管纤维化作用机制提供了新的理论依据，结合最新的研究发现胆盐膜受体(TGR5)可能参与介导了胆汁中疏水性胆盐对胆管的促纤维化作用，TRG5的促纤维化效应可能与整合素(ανβ6)介导的TGFβ1活化有关(“整合素-TGFβ轴”)，特异性的激活TGR5可以显著上调胆管上皮细胞整合素ανβ6和TGFβ1的表达[7]，但具体机制尚不完全清楚，而TGR5-JNK-ETS1-ανβ6-TGFβ1可能是其主要的信号通路之一。(1)TGR5:胆盐膜受体TGR5[5]是作为一种蛋白藕联受体(G-protein coupled receptor，GPCR)，此受体大部分含磷脂，属于脂蛋白;分子量约在150-400KD之间;N-末端位于胞外，C-末端位于细胞内，受体的信息需要G蛋白转换才能传递到靶效应器蛋白。近10年来通过分子克隆技术已经确定了1000多种与G-蛋白偶联受体的结构，如M型乙酰胆碱受体及大多数激素受体和部分离子通道受体。将TGR5转染至不含FXR等核受体的细胞系中发现细胞内的cAMP水平的快速升高并且这种效应对HBS呈剂量依赖性，说明TGR5所介导的是一条独立于FXR途径的HBS信号传导通路。国内外大量的组织学研究提示人体中TGR5主要分布在肝脏、胃肠和单核细胞，也可以表达于BEC[13]。但是TGR5是否参与胆管的损伤、修复过程，是否参与相关基因的转录及转录后的调控，这需要我们以HBS的促胆管纤维化作用为切入点对TRG5生理作用及在胆管病发病机制做进一步的探讨。已有研究证实HBS可以诱导TGR5内化(internalization)并能激活细胞外信号调节激酶MAPK(mitogen-activated protein kinase)及表皮生长因子受体(EGFR)[14]，这些相关证据的发现为我们解释了FXR途径无法解释的现象，也为我们进一步探讨HBS诱导肝内胆管纤维化中的作用与机制的研究提供了新的理论依据。进一步观察发现TGR5在不同胆管病即原发性胆汁性肝硬化和弥漫性肝胆管结石病例中肝内胆管上皮细胞TGR5表达显著上调。(2)JNK:c-Jun氨基末端激酶(JNK)家族是促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)超家族成员之一，以JNK为中心的JNK信号通路可被细胞因子、生长因子、应激等多种因素激活，大量实验提示JNK信号通路在细胞分化、细胞凋亡、应激反应以及多种人类疾病的发生与发展中起着至关重要的作用。在皮肤瘢痕修复[15]、肺纤维化[16]、肾纤维等均可以观察到JNK及TGFβ在成纤维细胞的过度表达，而新近的研究报道证明肝细胞中疏水性胆盐可以通过TGR5来激活JNK[17]。(3)EST1：端粒酶调控亚基(Est1)是一类在进化上非常保守的转录因子家族，主要是涉及细胞的发育、分化及增值的基因转录进行调控，也是多个信号转导通路的最终效应分子，其中JNK是目前已被证实比较明确的EST1调控因子[18]。(4)整合素(ανβ6)-TGFβ轴：目前有充分的证据提示整合素ανβ6可能参与了HBS对胆管纤维化的诱导，整合素ανβ6属于糖蛋白受体粘附分子家族，由αν和β6两个亚单位按1:1比例以非共价键聚合形成异二聚体，通常表达于上皮细胞，生理情况正常成人的体内表达水平极低;一旦组织发生损伤其整合素ανβ6表达则也会明显的上调，在皮肤瘢痕修复、肺纤维化、肾纤维等均可以观察到整合素ανβ6的明显上调[19]，新近报道整合素ανβ6在胆管纤维化中亦扮演着重要角色[20]。一般认为整合素ανβ6的致纤维化作用与TGFβ1的活化有关，TGFβ1是目前公认的作用最强的致纤维化细胞因子，已经证实其可以诱导胆管细胞(BEC)发生胆管纤维化[21]，正常分泌的TGFβ1是一种不能结合受体的、无活性的“潜在TGFβ”(latent-TGFβ)，整合素ανβ6可以与潜在TGFβ复合体结合并促使后者释放成熟的TGFβ1而发挥其生物效应，这一机制也被称为“整合素-TGFβ轴”(Integrin-TGFβ axis)[22]。新近来自Mdr2小鼠的研究表明，在HBS的作用下，整合素ανβ6及TGFβ1的表达随着胆管纤维化的发展而急剧上调，在出生后8周可达对照组表达水平的100倍[23]，同时还发现特异性的激活TGR5可以显著上调胆管上皮细胞整合素ανβ6和TGFβ1的表达[7]，给予特异性的ανβ6抑制剂可以明显降低胆管周围胶原沉积和内源性TGFβ1活化[24]，整合素ανβ6的活化很可能是HBS诱导胆管纤维化的一个关键环节，而最新报道的人β6整合素的启动子序列中发现了转录因子ETS1的结合位点，EST1能与其结合并增强启动子活性[25]。因此，目前的资料表明很可能TGR5通过激活JNK来促ETS1与β6整合素启动子结合进而促进其表达及活性TGFβ的释放(TGR5-JNK-ETS1-ανβ6-TGFβ1)发挥其生物效应促进胆管纤维化。
4 结 论
综上所述，胆汁中的疏水性胆盐(HBS)通过TGR5来激活JNK[17]，而JNK是目前已被证实比较明确的EST1调控因子[18]，在人β6整合素的启动子序列中发现了转录因子ETS1的结合位点，EST1能与其结合并增强启动子活性[25]，整合素ανβ6可以与潜在TGFβ复合体结合并促使后者释放成熟的TGFβ1而发挥其生物效应，TGFβ1是目前公认的作用最强的致纤维化细胞因子，在HBS的作用下，整合素ανβ6及TGFβ1的表达随着胆管纤维化的发展而急剧上调，特异性的激活TGR5也可以显著上调胆管上皮细胞整合素ανβ6和TGFβ1的表达[7]。说明了胆盐膜受体TGR5可能通过激活JNK来促ETS1与β6整合素启动子结合进而促进其表达及活性TGFβ的释放发挥其生物效应促进胆管纤维化，而TGR5-JNK-BTS1-ανβ6-TGFβ1可能是其主要的信号通路之一。因此，随着分子生物学技术的发展，信号通路研究的深入，将进一步阐明TRG5在诱导胆管纤维化作用的分子机制，为临床针对胆管病高效的诊断及特异的治疗提供新的思路，也为我们从分子水平预防胆管病的发生及发展提供理论依据。总而言之，对胆管病发病机制及防治机理的研究具有重要的科学意义及现实意义。
参考文献
[1] Zhou Binzhang，Pei-jian.The physiology of the bile duct epithelial cell and its relationship to diseases of bile duct[J].Chiese journal of genral surgery，2007，16(7):30-44.
[2] 张建辉.医源性胆管损伤的诊断与治疗[J].中国实用医刊，2009，36(22)，72-73.
[3] 陈志宇，李晓武，董家鸿.肝移植术后缺血型胆管病变[J].肝胆外科杂志，2005，13(1)：75-76.
[4] Migita K，AbiruS，MaedaY.Elevated serum BAFF levels in patients with auto-immune hepatitis[J].Hum Immunol，2007，68(7)：586-591.
[5] Kawamata Y，Fujii R，Hosoya M et al.A G-protein-coupled receptor respon- sive to bile acids[J].Jbiol chem，2003，278:9435-9440.
[6] Tsuboi K，Tzuma S，Nishioka T et al.Partial characterization of cytoprotec-tive mechanism of lecithin against bile salt-induced damage[J].J Gastroenterology，2004， 35(9):955-960.
[7] Chen G，Wang SG，Bie Petal.Endogenous bile salts are associated with bile duct Injury in the rat liver transportation model[J].Transportation，2009，87：330-339.
[8] Lammert F，Wang DQ-H，Hillebrandt S et al.Spontaneous cholecysto-and hepato-lithiasis in MDR2-/- mice:a model for low phospholipid-associated cholelithiasis[J].Hepatology，2004，39:117-128.
[9] Popov Y，Patsenker E，Fickert P et al.Mdr2(abcb4)-/-mice spontaneously develop severe biliary via massive dysregulation of pro- and antifibrogenic genes[J].J Hepatology，2005，43:1045-1054.
[10]Fickert P，Fuchsbichler A，Wanger Met al.Regurgitation of bile acids from lealy Bile dusts causes sclerosing cholangitis in mdr2 knockout mice[J].Gastroenterology，2004，127:261-274.
[11]Zhang Y，Edwards PA.FXR signaling in metabolic disease[J].FEBS Lett，2008，582:10-18.
[12]Fiorucci S，Antonelli E，Rizzo G et al.The nuclear recepter SHP mediates inhibition of hepatic stellate cells by FXR and protects against liver fibrosis[J].Gastrroenterology，2004，127: 1497-1512.
[13]Keitel V，Donner M，winandyS et al.Expression and function of the bile acid receptor TGR5 in kupffer cells[J].BBRC，2008，372:78-84.
[14]Yasuda H，Hirata S;Inoue K et al.Involovement of menbrane-type bile acid receptor M-bar/TGR5 in bile acid-induced activation of epidermal growth factor receptor and mitrogen-activated protein kinases in gastric carcinoma cells[J].BBRC，2007，354:154-159.
[15]张 斌，马显杰，刘 宾.JNK和TGF-β信号途径协同介导CTGT在瘢痕疙瘩成纤维细胞中过度表达[J].中国美容医学，2009，4(18):506-509.
[16]Lu GD，Shen HM，Chung MC，et al.Critical role of oxidative stress and sustained JNK activation in aloe-emodin-mediated apoptotic cell death in human hepatoma cells[J].Carcinogenesis，2007，28(9):1937-1945.
[17]Yang JI，Yoon JH;Myung DJ et al.Bile acid-induced TRG5-dependent c-jun-N Terminal kinase activation leads to enhaned caspase 8activation in hepatocytes[J].BBRC，2007，361:156-161.
[18]Turner DP，Findlay VJ，Moussa O et al.Defining ETS transcription regula-tory networks and their contribution to breast cancer progression[J].J Cell biochem，2007，102:545-549.
[19]Puthawala K，Hadjiangelis N，Jacoby SC et al.Inhibition of intergrin alphabete6;an activat -or of latent transforming growth factor-beta: prevents radiation-induced lung fibro-sis[J].Am J Respir Crit Care Med，2008，177:82-90.
[20]Wang.B，Dolinski BM;Kikuchi N et al.Role of ανβ6 integrin in acute Biliary fibrosis[J].Hepat-ology，2007，46:1404-1412.
[21]Rygiel KA，Robertson H，Marshall H，et al，Epithelial-mesenchymal transition Contributions to portal tract fibrosis during human chronic liver disea[J].Lab Invest，2008，88:112-123.
[22]Munger JS，Huang XZ，Kawakatsu H et al.The integrin ανβ6 binda and activates latent TGFβ1;a mechanism for regulating pulmonary inflammation And fibrosis[J].Cell，1999，96:319-328.
[23]Popov Y，PatsenkerE，Stickel F et al.integrin ανβ6 is a marker of the progression of bilia-ry and porral liver fibrosis and a novel target for antifibrotic therapies[J].J Hepatology，2008，48:453-464.
[24]Paseker E，Popov Y，Stickel F et al.Inhibition of integrin ανβ6 on Cholangiocytes blocks transforming growth factor-β activiation and retards biliary fibrosis progression[J].Gastroenter-ology，2008，135:660-670.
[25]Bates RC，Bellovin DI，Brown C et al.Ttranscriptional activation of integrin β6 during the epithlial-mesenchymal transition defines a novel progonostic indic -ator of aggressive colon carcinoma[J].J Clin Invest ，2005，115:339-347.