【摘要】 目的 探讨大肠癌伴血吸虫病中Survivin 、Caspase-3、AKT1蛋白的表达及其意义。方法 采用免疫组化技术检测40例大肠癌伴血吸虫病中Survivin 、Caspase-3、AKT1蛋白的表达，并与35例不伴血吸虫病的大肠癌及40 例正常结肠粘膜作对照。结果 AKT1 在大肠腺癌中的表达与正常大肠粘膜相比有显著意义(P&<0.01)，在大肠腺癌中Survivin的阳性率与正常大肠粘膜相比，差异具有显著性意义(P&<0.01)，caspase-3在大肠腺癌中的阳性表达率与对照组相比差异无统计学意义(P&>0.05)。AKT1 在大肠腺癌不伴血吸虫病、伴血吸虫病中阳性表达率分别为85.7%和82.5%，差异无统计学意义(P&>0.05)。Survivin在大肠腺癌不伴血吸虫病、伴血吸虫病中表达率分别为91.4%，90.0%，差异无统计学意义(P&>0.05)。caspase-3在大肠腺癌不伴血吸虫病、伴血吸虫病中表达率分别为57.1%，62.5%;差异无统计学意义(P &>0.05) 。结论 在大肠癌变过程中起重要作用的三种基因(AKT1、Survivin、caspase)的改变与血吸虫病无明确关系，因此血吸虫病与大肠癌之间的关系还需进一步探讨。
【关键词】 大肠癌伴血吸虫病;凋亡抑制因子;细胞周期调控
目前对大肠癌的发生、发展已进行多方面的研究，但大肠癌伴血吸虫病的相关研究报道不多。AKT1是细胞生存通路PI3K/AKT的关键分子，其持续活化与组织增殖密切相关， Survivin 是迄今发现最强的凋亡抑制因子，具有抑制凋亡效应蛋白酶Caspase 活性、参与细胞周期调控及调节细胞有丝分裂等多种生物学作用。细胞凋亡的异常与肿瘤发生发展密切相关，而Caspase-3 在凋亡过程中起着重要的作用。为此，我们应用免疫组织化学方法检测大肠癌伴血吸虫病组织中AKT1、Surviving 、Caspase-3蛋白的表达，以探讨血吸虫感染与大肠癌发生的关系。
1 材料与方法
1.1 研究对象 标本取自我院病理科2002年至2005年期间手术大肠腺癌标本75例，男性39例，女性36例，年龄36～79岁，平均48岁;年龄&<60岁者36例，≥60岁者39例。肿瘤病理分级：高分化腺癌28例、中分化腺癌35例、低分化腺癌12例。其中40例大肠腺癌中见钙化血吸虫卵沉积。采用免疫组化技术检测40例大肠癌伴血吸虫病组织中Survivin 、Caspase-3、AKT1蛋白的表达水平，并与35例不伴血吸虫病的大肠癌及40 例正常结肠粘膜组织作对照(大肠粘膜伴/不伴血吸虫病各20例)。
1.2 研究方法 标本均经10%的甲醛固定，常规石蜡包埋，切片厚4～5um，载玻片经多聚赖氨酸处理，防止脱片。微波抗原修复。鼠抗人AKT1免疫组化单克隆抗体，兔抗人Survivin免疫组化多克隆抗体，鼠抗人caspase-3免疫组化单克隆抗体兔抗人，免疫组化试剂盒、DAB显色剂试剂盒均购自福州迈新公司。染色步骤按试剂盒说明书操作。PBS冲洗，DAB显色，苏木素复染，常规脱水透明，树胶封片。以PBS代替一抗作阴性对照。光镜下任取4个高倍视野进行细胞计数，至少计数200个细胞，AKT1阳性着色定位于细胞的胞质和(或)胞膜，呈淡黄～棕黄色细颗粒状，局灶或弥漫性分布。Survivin阳性着色主要定位于细胞的胞质和胞核上，呈淡黄～棕黄色细颗粒状，阳性细胞呈局灶或弥漫性分布。caspase-3的阳性着色在细胞的胞质中，呈淡黄～棕黄色细颗粒状，局灶或弥漫性分布。采用半定量积分法[1-3]判定免疫组化染色结果：计算阳性细胞百分数并赋予分值，≤ 5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，﹥75%为4分;观察着色强度并赋予分值，无着色为0分，浅黄着色为1分，黄色为2分，棕黄着色为3分，两者相乘，0分为(-)，1～4分为(+)，5～8分为(++)，9～12分为(+++)。
1.3 统计学方法 采用统计学软件SPSS 13.0进行处理。AKT1、Survivin、caspase-3在大肠腺癌与对照组间的表达差异用四格表的χ2检验，Spearman秩相关进行AKT1、Survivin、caspase-3间的相关性分析， P =0.05为检验水准，P&<0.05差异有显著性意义，P&<0.01差异有非常显著性意义。
2 结 果
2.1 AKT1在大肠腺癌中的表达AKT1 在正常大肠粘膜不伴血吸虫病、正常大肠粘膜伴血吸虫病、大肠腺癌不伴血吸虫病、大肠腺癌伴血吸虫病中表达率依次为15%，10%，85.7%和82.5%;其在大肠腺癌与正常大肠粘膜中的表达率相比，差异有非常显著性统计学意义(P&<0.01)，但在大肠腺癌不伴血吸虫病与大肠腺癌伴血吸虫病相比，其表达率差异无统计学意义(P&>0.05)( 见表1)。
2.2 Survivin在大肠腺癌中的表达 Survivin在正常大肠粘膜不伴血吸虫病、正常大肠粘膜伴血吸虫病不表达，在大肠腺癌不伴血吸虫病、大肠腺癌伴血吸虫病中表达率分别为91.4%，90.0%;其在大肠腺癌与正常大肠粘膜中的表达率相比，差异有非常显著性统计学意义(P&<0.01)，但在大肠腺癌不伴血吸虫病与大肠腺癌伴血吸虫病相比，其表达率差异无统计学意义(P&>0.05)，见表1。
2.3 caspase-3在大肠腺癌中的表达 caspase-3在正常大肠粘膜不伴血吸虫病、正常大肠粘膜伴血吸虫病、大肠腺癌不伴血吸虫病、大肠腺癌伴血吸虫病中表达率分别为80.0%，75.0%，57.1%、62.5%，大肠腺癌与正常大肠粘膜中的阳性表达率相比明显降低，在伴血吸虫病组降低12.5个百分点，在不伴血吸虫病组降低22.9个百分点，但组间差异无统计学意义(P&>0.05);大肠腺癌不伴血吸虫病与大肠腺癌伴血吸虫病相比，其阳性表达率差异无统计学意义(P &>0.05) ，见表1。
2.4 大肠腺癌中AKT1、Survivin和caspase-3表达的相关分析 在AKT1表达阳性的63例患者中，有61例Survivin表达阳性，在12例AKT1表达阴性的患者中，有5例Survivin表达阴性，Spearman秩相关分析显示，AKT1与Survivin的表达存在显著正相关(r=0.490，P&<0.01)。Spearman秩相关分析结果显示Survivin与caspase-3的表达无相关性(P&>0.05)，caspase-3与AKT1的表达无相关性(P&>0.05)。(见表2～4)
2.5 血吸虫病对大肠腺癌AKT1、Survivin和caspase-3表达的影响及其与病理特征的关系
AKT1 在大肠腺癌不伴血吸虫病、大肠腺癌伴血吸虫病中阳性表达率分别为85.7%和82.5%，差异无统计学意义(P&>0.05)( 见表1)。Survivin在大肠腺癌不伴血吸虫病、大肠腺癌伴血吸虫病中表达率分别为91.4%，90.0%，阳性表达率差异无统计学意义(P&>0.05)( 见表1)。caspase-3大肠腺癌不伴血吸虫病、大肠腺癌伴血吸虫病中表达率分别为57.1%，62.5%;阳性表达率差异无统计学意义(P &>0.05) (见表1)。表1 AKT1、Survivin、caspase-3在大肠粘膜及大肠腺癌中的阳性表达表2 大肠腺癌中Survivin、AKT1表达的相关性分析表4 大肠腺癌中caspase-3、AKT1表达的相关性分析
3 讨 论
3.1 ATK1，Survivin，caspase-3三种基因蛋白与大肠癌的关系 近年来，PI3K /AKT通路受到很大关注，AKT1是该通路中的关键分子，其持续活化与细胞增殖密切相关，AKT1的多种底物均具有促进细胞生长增殖的作用[1]。本研究结果显示，AKT1 在大肠腺癌中的表达率与正常大肠粘膜中的表达率相比差异有非常显著统计学意义(P&<0.01)，提示在大肠腺癌的发生发展过程中，AKT1的高表达与肿瘤的演变过程中起着重要作用。可以作为大肠腺癌基因治疗的一个良好靶点。
凋亡抑制基因Survivin是目前发现的最强的凋亡抑制因子，也是迄今发现的唯一通过内源性抑制caspase活性而抑制细胞凋亡的因子。在多种肿瘤的发生发展过程中起重要作用，并与肿瘤的转移、血管浸润等恶性生物学行为有关[2]，可作为肿瘤治疗的特异性靶点。本研究结果显示，Survivin在正常大肠组织中不表达 (0/40)，在大肠腺癌中Survivin的阳性率与正常大肠粘膜相比，差异具有极显著性意义(P&<0.01)，提示Survivin的表达上调对大肠腺癌的发生发展中起着重要作用，可认为是基因治疗靶点。
研究表明，目前已发现14种以上caspase家族成员，其中caspase-3是该家族中最重要的成员，大多数触发细胞凋亡的因素，最终都需要通过caspase-3介导的信号传导途径导致细胞凋亡[3-4]。本研究结果显示，caspase-3在大肠腺癌中的阳性表达率与对照组相比有下降，但组间差异无统计学意义(P&>0.05)。
本研究结果显示，68例Survivin表达阳性者中AKT1表达阳性者有61例，其表达强度也呈相同的变化趋势，为明显正相关，提示二者具有协同作用，说明在Survivin阳性组，AKT1一直处于激活状态，即p-AKT1水平与Survivin密切相关。而Survivin与AKT1之间是否有直接的相互作用，具体通过哪种机制相互影响，尚有待进一步证实和研究。另外本研究结果显示，AKT1与caspase-3、Survivin与caspase-3之间无明确相关性。在大肠腺癌中，AKT1、Survivin呈高表达，caspase-3呈低表达，提示AKT1、Survivin以及caspase-3在大肠癌癌变过程中发挥重要的作用，AKT1与Survivin之间呈正相关，它们相互协同，共同促进了大肠癌的发生发展。AKT1 、Survivin在大肠腺癌中的表达明显高于正常对照组，可以作为大肠癌早期诊断的筛选指标。
3.2 从三种基因蛋白的表达来分析血吸虫与大肠癌发生的关系 日本血吸虫是一种线状吸虫，其成虫成对生活在肝外门静脉血管中，并在肠粘膜下层小静脉内产卵。宿主感染血吸虫后其病变主要由虫卵引起，虫卵肉芽肿为其基本病理改变。由于反复感染，它可不断破坏肝肠的正常组织结构，血吸虫卵的长期刺激在肠道可引起腺体粘膜异常增生，但这种增生的粘膜是否会发生癌变尚不清楚。血吸虫虫卵肉芽肿的形成是一个慢性炎症反应过程，而慢性炎症反应的过程中炎症灶处的巨噬细胞可释放活性氧，破坏DNA、蛋白质、细胞膜，改变酶的活性及基因的表达，因此认为慢性血吸虫病是可促进肿瘤的发生。大肠的慢性血吸虫病是否会增加肠癌的发病率虽有争议，但在重度慢性炎症所致的结构异常的基础上存在癌变的可能。多数情况下，大量虫卵的沉积与肠癌发生有关，结肠肠壁纤维组织增生，肠壁各层与癌组织之间，均可见到变性或钙化虫卵沉着，癌症附近的粘膜内有较多的虫卵或炎性息肉形成，并能找到在腺瘤基础上发生癌变的组织病理学根据，晚期血吸虫病并发结肠癌，是由于虫卵长期刺激结肠组织的结果，因此，血吸虫是大肠癌的一种诱发因素[5]。
20世纪70年代全国恶性肿瘤死因调查发现，大肠癌死亡率最高的地区为浙江嘉善县，该县近20年基本消灭了血吸虫病严重流行现象，但该地区大肠癌发病率死亡率未见降低。血吸虫病可能增加大肠癌发病危险，但当调整病程因素后，该联系未达到显著性水平，血吸虫病与大肠癌间有无明确的因果关系尚存在争议，而到目前为止尚没有从血吸虫虫卵中分离出任何的致癌物，因此血吸虫病与肠癌之间的关系需进一步探索[6-7]。另外，在对肝脏血吸虫病所做的研究亦没有发现任何的依据表明血吸虫与肝癌之间存在明显的联系[8]。
一般认为，肿瘤的发生也是一个多因素、多阶段、多基因参与的复杂过程，在此过程中多个不同的基因发生了激活或失活，大肠癌也不例外。在大肠癌癌变的过程中，多个基因发生了改变，那么机体感染日本血吸虫后是否会引起一些相关的基因发生改变，本研究做了一些有限的相关分析。本研究结果显示，大肠癌伴血吸虫病与大肠癌不伴有血吸虫病两组病例之间ATK1，survivin，caspase-3三种基因蛋白表达水平的差异无统计学意义(P&>0.05)，提示在大肠癌变过程中起重要作用的三种基因AKT1、Survivin、caspase的改变与血吸虫病无明确关系，或者血吸虫在基因突变中所起的作用微弱，因此血吸虫病与大肠癌之间的关系还需进一步探讨。
参考文献
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