【关键词】 缺氧；肝癌；多药耐药
肿瘤细胞的多药耐药性(multiple drug resistance， MDR) 是指肿瘤细胞接触一种抗癌药物后，不仅对该药产生耐药性，对其他结构和作用机制不同的多种抗肿瘤药物也可产生交叉耐药性。肝癌是临床常见的对化疗不敏感的恶性肿瘤，研究已证实多药耐药是肝癌化疗无效或渐失效的主要原因。肝癌多药耐药产生存在多种机制，近年来，已有大量文献对肝癌细胞缺氧与肝癌MDR的发生机制、临床意义等方面展开了深入研究，本文就缺氧与肝癌多药耐药作一综述。
1 肝癌多药耐药产生机制
肝癌的MDR产生机制复杂，主要有以下几个方面：(1)P170糖蛋白( P-gP)P-gP由7号染色体上的多药耐药基因1 (Multidrug Resistance Genel，MDR1)编码的糖蛋白，它是一种相对分子量为170KD、具有能量依赖性“药泵”功能的跨膜糖蛋白，属于ABC转运蛋白超家族成员，其能将细胞内带阳性电荷的亲脂类化疗药物逆浓度泵至细胞外，使细胞内化疗药物达不到有效作用浓度而产生耐药性［1］。(2)多药耐药相关蛋白( MRP ) 1992年，从人小细胞肺癌耐药细胞株H69AR中克隆出MR基因，其编码的P190蛋白，即多药耐药相关蛋白(MRP)，属ABC跨膜转运蛋白超家族的成员，可介导蒽环类抗生素、长春生物碱、鬼臼乙叉甙等多种化疗药物自细胞内外排或改变药物在细胞内的分布而导致MDR［2］。已经发现，在对化疗不敏感的肝癌等多种恶性肿瘤患者体内及体外培养的多种不同组织来源的恶性肿瘤耐药细胞株中，MRP基因或P190蛋白的表达升高［3］。Akan等［4］证明N-乙酰半胱氨酸可以增加人类胚肾细胞(HEK293)及其转染全长MRP1的293MRP细胞，而DL-Buthionine(S ，R) -sulfoximine(BSO)可以降低其效应，由于N-乙酰半胱氨酸是一种谷胱甘肽前体，BSO可以抑制GSH的合成， 表明MRP1 耐药性的产生依赖于GSH。MRP1 能将带有负电荷的药物泵出细胞 ；也参与胞质囊泡的运输， 可引起细胞内药物再分布，使重要的攻击靶点(如核酶) 的药物减少，形成MDR［5］。(3)肺耐药蛋白(LRP) LRP是由位于16p13.1 .1 3 .2基因编码的产物，首先发现于MDR的肺癌细胞株中，是一种管状结构的人类的穹隆体蛋白。L RP主要从胞核转运一些 P .g P和 MRP不能介导的药物如顺铂、卡铂、烷化剂等到胞浆，改变细胞内的药物分布，使药物远离作用靶点，通过核靶点屏蔽机制产生耐药［6］。(4)调亡与抗调亡机制失衡 Bcl - 2家族是目前最受重视的调控细胞凋亡的基因家族。其家族可分为两大类：凋亡抑制基因如Bcl-2、Bcl-x l、Bc1． W等和凋亡诱导基因如 bax、 Bcl -XS、bad、bak等，这两类基因的相互作用可调节细胞的凋亡，其中编码与耐药有关的是Bel - 2。Markova研究发现应用MDR拮抗剂后出现Bcl-2 的低水平表达。Perkings［7］等也发现了在有MDR的类急性白血病细胞中 Bcl - 2的过度表达。Klhler等在对119例急性骨髓白血病的早期、后期治疗对比中发现Bcl - 2的绝对转录水平升高。
2 肝癌细胞缺氧及其分子反应
局部微环境缺氧在许多实体瘤中是常见现象。肿瘤组织中的氧状况取决于氧的供给、弥散及氧耗。缺氧主要是由于肿瘤生长迅速，氧的消耗及弥散距离增加；而肿瘤血管往往异常增生、管壁萎陷、血流淤滞、血供不足，因而使得肿瘤区域氧的供求失衡而相对缺氧。距毛细血管同样远近的肿瘤组织较正常组织中氧浓度低10～100倍，当肿瘤球体直径达到2009～3009m时其中心氧分压即下降到很低(缺氧)。而且肿瘤内部的缺氧程度是不均一的，通常地，以肿瘤的中央为轴心，缺氧的程度向外渐次减弱，亦即越靠近肿瘤中心缺氧时间越长、缺氧越为严重［8］。
肝癌细胞组织内缺氧尤为显著，肝细胞癌通常是由慢性肝损伤、肝硬化发展而来。肝脏的慢性损伤导致肝细胞性状的改变继而引起肝组织硬化，并破坏肝内正常的血供系统。肝血供系统的破坏进一步导致肝供血不足、肝组织内缺氧。而且，随着肿瘤细胞的高度增殖、数量增多、肿瘤体积增大，也引起肝癌组织内更严重的缺氧。机体为对抗这种缺氧的微环境，会发生了一系列适应性改变，肿瘤细胞的基因组／蛋白组发生变异，肝癌表现出某些新的生物学性状［9］。
肝癌细胞在缺氧情况下，发生一系列生化改变适应缺氧，包括无氧糖酵解的增强，保护性应激蛋白的表达提高等。后者包括一些细胞因子和生长因子，如促红细胞生成素(erythrop- oietin，EPO)、VEGF、糖酵解酶等;转录调控因子的改变有A P -1、和缺氧诱导因子(hypoxia - inducible factor 1，HIF- 1 ) 等［10］。
3 缺氧与肝癌多药耐药
在肝癌多药耐药形成机制中，肝癌细胞组织缺氧起着十分重要的作用。Zhu等［11］研究表明在缺氧环境中的HepG2人肝癌细胞随着缺氧时间的延长，多药耐药相关基因mdrl、MRP1、LRP的mRNA和蛋白水平的表达量也逐渐增高。尤以MRP1变化更为显著；但在恢复供氧后这些多药耐药相关基因的表达即开始下降。这些现象提示周围环境的缺氧可诱导肝癌细胞高表达mdrl、LRP、MRP1等多药耐药相关基因，而这些基因的表达直接参与了肝癌多药耐药表型的形成，因此我们可得出结论：肝细胞癌的多药耐药性可由其生长局部微环境的缺氧而诱导；肝癌在其生长微环境缺氧等因素的影响下因细胞内多药耐药相关基因的表达升高而获得了多药耐药的表型。
核转录因子HIF-1 ( hypoxia induced factor- l，缺氧诱导因子-1)是细胞缺氧状态下稳定表达的中心调节因子，可在转录水平调节诸多靶基因的表达［12］。H1F -l是一种异源二聚体转录因子，由α亚基和β亚基组成，二者都是具有螺旋-环-螺旋( bHLH) 结构的碱性蛋白。HIF -1基因定位于人染色体14q21-2 4。在HIF-1的N端具有PAS和bHLH结构域。PAS结构域含有个长度大约50个氨基酸的同源重复序列，由His-X–X-Asp顺序构成。PAS结构域与异二聚化有关，可能影响DNA的结合及转录激活。BHLH结构域在许多转录因子中介导HIF-1α和HIF- 1β亚基形成二聚体并与DNA结合，HIF-1α和HIF-1βC端都有一个或多个激活区域，主要参与转录激活作用［13］。常氧下HIF-l α通过泛素-蛋白酶体途径很快降解。缺氧时HlF的泛素化急剧减少，并从胞浆转位至胞核，HIF -B形成二聚体。H1F -l 二聚体通过 HIF- 1碳末端的入核信号诱导入核，与缺氧诱导基因的HRE (hypoxia response elenment，缺氧反应元件)上的HIF-lα结合位点结合，促进缺氧诱导基因转录，而引起一系列细胞对缺氧的反应 ［14］。
目前的研究结果显示核转录因子HIF-1α参与调控多种肿瘤细胞中多药耐药相关基因的表达，证实HIF-1α与肿瘤的耐药有关［15］。国内外研究表明多药耐药相关基因表达增高与HIF-1α的表达呈同步化改变，而且在HIF-1α／PCDNA3.0质粒稳定转染的HepG2细胞中，mdrl、LRP、MRP1基因的mRNA和蛋白水平的表达均显著升高。这提示核转录因子HIF-1α可促进细胞内多药耐药相关基因表达。以上结果表明HIF-1α是介导肝癌细胞产生 MDR的重要核转录因子， 缺氧可通过活化 HIF-1α促进多药耐药相关基因的转录，使这些基因编码的药物泵蛋白合成增多，增加对化疗药物非选择性的外排。据此，我们可得出结论:在缺氧环境中缺氧这一物理因素可通过核转录因子HIF-1α来调控多药耐药相关基因的表达，从而使肝癌在化疗中表现出多药耐药的特性［16］。Katrina Mc［17］等已证实MDR1基因是缺氧反应性基因，在该基因启动子上存在着功能性的HRE，这进一步从基因结构水平提供了确凿的依据。
缺氧还可引起肝癌细胞凋亡与抗凋亡机制的失衡。Hammond等［18］研究发现，低氧可致转化的鼠胚胎成纤维细胞发生凋亡，而且凋亡依赖于野生性p53。将此细胞株接种于免疫缺陷小鼠，发现缺氧区域野生性p53细胞发生凋亡较多，而p53突变细胞凋亡细胞明显减少。这些发现提示，缺氧的选择作用使得p53突变细胞得以更好的生存。定位于1号染色体的p53基因是体内重要的细胞凋亡控制基因。该基因的异常表达野生型p53基因转变为突变型p53基因，与肝癌的耐药密切相关 ［19］ 。p53在HCC中的突变率较高，由此产生的大量突变p53蛋白将影响下游基因的调控［20］，如 Bcl -2 、Bax等，从而抑制肿瘤细胞凋亡，介导MDR。野生型p53可提高HCC细胞对化疗药物，如5-氟尿嘧啶的敏感性，起到协同作用。Li YX等［21］的研究发现将野生型p53转染至人肝癌多药耐药细胞株BEL-7402／5-F U后，不仅可以诱导癌细胞凋亡，还可增强肝癌细胞对5-F U、长春新碱及阿霉素的敏感性。
缺氧还通过其他一些途径导致肝癌细胞耐药。(1)缺氧导致瘤细胞停止或减慢增殖速率， 其原因不是简单的能量产生减少，而是缺氧引起特异蛋白表达增加，后者抑制细胞周期。而化疗药物对增生旺盛的细胞有比较强的杀伤活性，因此缺氧将降低化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用。(2)抗癌药物浓度在靠近血管周围最高，这不仅因为药物是由大血管向周围小血管输送，而且许多抗癌药物的反应活性限制了其从血管的进一步扩散，尤其对一些通过物理作用与DNA结合的药物如烷化剂。(3)缺氧所致细胞外pH值下降，由于细胞自身的调节使得胞内pH值无明显下降，这种细胞内外pH梯度不利于某些弱碱性药物在细胞内积累， 如阿霉素，也不利于弱酸药物如苯丁酸氮芥向胞内扩散。总之，有多种因素致使抗癌药物对远离血管的肿瘤细胞杀伤作用减弱［22］。
4 小 结
综上所述，逆转肝癌细胞多药耐药已成为肝癌治疗研究的重要内容。缺氧作为恶性实体瘤的特征之一，不仅改变了肿瘤细胞的生物学特性，而且也是肿瘤对化疗产生抗性的主要原因。随着对缺氧研究的深入，利用肝细胞肿瘤特殊的缺氧微环境，发展新型高效高选择性的治疗方法，必将面临越来越多的机遇。
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