作者：韩克强，吴娅利，梁平△，李靖，王细文，黄小兵
【摘要】 目的 探讨肝细胞癌变过程中Rb基因产物(Rb蛋白)的异常表达及其意义。方法 用0.2%二乙基亚硝胺(DEN)诱导Wistar大鼠建立肝癌动物模型，应用免疫组化法检测Rb蛋白在大鼠肝脏癌变及转移过程中的表达。结果 正常组20只中均见Rb蛋白表达，肝硬化组21只中有18只Rb蛋白过表达，肝癌组（未转移）68只中有37只Rb蛋白过表达，肝癌组（伴转移）18只中有3只Rb蛋白过表达。结论 Rb蛋白的阳性表达率随病变程度的加重而逐渐降低，这辅证了Rb蛋白在肝细胞癌形成过程中发挥抑癌作用，Rb蛋白的失活可能促进肝癌形成，并与肝癌的发展、转移密切相关。
【关键词】 肝细胞癌 Rb基因 免疫组化 大鼠
Abstract Objective To discuss the abnormal expression of retinoblastoma protein (Rb) gene product in the hepatocellular carcinogenesis and its significance.Methods 0.2% N-nitrosodethylamine (DEN) was applied to induce Wistar rats to form the model of hepatocellular carcinoma (HCC)， and the expression of Rb protein in HCC carcinogenesis and metastasis was detected with immunohistochemical method.Results 20 rats in control group all showed the expression of Rb protein， 18 rats out of the 21 rats in liver cirrhosis group had the expression of Rb protein as well as 37 rats out of the 68 rats in HCC (without metastasis) group， and only 3 rats out of the 18 rats in HCC (with metastasis) had the expression of Rb protein.Conclusions Uhe positive expression rate of Rb protein decreases gradually with the aggravation of lesion degree， which may assist that Rb protein play an inhibiting role in hepatocellularcarcinoma， its inactivity may promote the genesis of HCC and is closely related to the progress and metastasis of HCC.
KEYWORDS hepatocelluar carcinoma Rb gene immunohistochemistry rat
近年来的研究表明，细胞周期调节失控是癌变的重要原因。抑癌基因Rb(视网膜母细胞瘤基因)编码的蛋白Rb是细胞周期重要的调节因子，在细胞周期G1到S期中主要起负调节作用，以防止细胞增殖失控向肿瘤性增生转化。已经在人类多种肿瘤中发现Rb基因的突变或缺失，但其在肝细胞肝癌(HCC)发生发展中的抑癌机制尚未完全阐明。为进一步评价Rb蛋白在肝癌形成及发展中的作用，我们应用二乙基亚硝胺(DEN)构建了大鼠肝细胞癌模型，动态观察肝细胞由正常、肝硬化、肝癌到转移这个过程中Rb蛋白表达的变化，来验证Rb蛋白与肿瘤的关系，从而为研究肿瘤的基因治疗提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 实验用清洁级雄性Wistar大鼠140只，9～10周龄，体重150g±20g，购自第三军医大学野战外科研究所实验动物中心。
1.1.2 试剂和仪器 二乙基亚硝胺(DEN) 购自美国Sigma公司，兔抗鼠免疫IgG(Rb蛋白)多克隆抗体多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，S-P免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒、抗体稀释液购自北京中山生物技术有限公司。IX70型相差倒置显微镜购自日本Olympus公司。
1.2 方法
1.2.1 大鼠肝细胞癌模型的制备 实验大鼠随机分为对照组和实验组，实验组120只，对照组20只。实验组
参考文献
方法［1～3］，并改进方法诱导肝细胞癌模型，经口咽插管至胃灌喂0.2%二乙基亚硝胺(DEN)溶液，每天1ml，每周连续灌喂5天，其余2天自由饮水，至第19周完后停止给药，对照组以同样方法灌喂等量生理盐水。于诱导第16、18、20、22、25周分批行MRI扫描后处死，并解剖观察肝脏成瘤情况及有无转移，对照组同时处死4只。取部分漂洗后肝脏放于10%中性福尔马林固定，留做病理学检查及免疫组化检测，光镜观察肝脏病理变化，按大鼠肝肿瘤国际组织学分类标准进行形态判定［4］，并按分化程度分级。其余肝脏投入液氮备用。实验过程中有41只大鼠死亡，对照组全部存活，实验组累计检测标本107例。1.2.2 免疫组织化学检测 石蜡切片按S-P试剂盒要求操作，经脱蜡、脱水，消除内源性过氧化物酶活性后，进行微波抗原修复。依次滴加正常山羊血清、一抗(1:200稀释)、二抗、辣根酶标记的链霉卵白素工作液，DAB显色后常规复染、脱水、透明、封片，光镜观察、拍照。以0.02M PBS代替一抗作阴性对照，以正常大鼠肝脏切片作阳性对照。
1.2.3 免疫组化结果判定 细胞染色阳性以细胞核或细胞浆着棕黄色或棕褐色为准，染色结果参照Mark Kelley实验室标准［5］进行肿瘤细胞阳性计分。首先在高倍镜下计数1000个肿瘤细胞，避开肿瘤边缘及坏死区域，根据阳性肿瘤细胞数目所占百分比得出细胞核或细胞浆标记指数（Labeling index， LI），即细胞核或细胞浆LI＝阳性瘤细胞数/1000个肿瘤细胞×100%。分为以下四级计分：&<10%记为0分，10%～25%记为1分，25%～50%记为2分，&>50%记为3分；染色强度按大多数肿瘤细胞着色的深浅计分：阴性记为0分，显色为黄色（弱阳性）记为1分，显色为棕黄色（中等阳性）记为2分，显色为棕褐色（强阳性）记为3分。再将这两项分值相加的总积分即为免疫组化的阳性分度：0分为阴性，记为(-)；1～2分为弱阳性，记为(+)；3～4分为阳性，记为(++)；5～6分为强阳性，记为(+++)。
1.3 统计学方法 免疫组化结果应用SPSS 11.0统计软件χ2检验进行分析。P&<0.05或P&<0.01表示差异显著或非常显著。
2 结果
2.1 肝细胞癌形成、发展过程中的病理变化 Wistar大鼠在诱导16周以前病理主要以肝硬化为主，并出现4例肝细胞癌（高分化肝癌为主）。诱导第17～22周以肝细胞癌为主，第23周及以后多出现转移，腹腔内可见肿大的淋巴结，可见肝内、门脉、肺脏及腹腔等处转移，部分有血性腹水。大鼠肝细胞癌（其中以梁索型和腺样型居多）病理分级可分为高分化、中分化及低分化三级，本组例数分别为35、29、22例。对照组未发现异常病理改变。见表1。
表1 肝细胞癌形成过程中的病变统计（略）
2.2 Rb蛋白在不同病变肝组织中的表达 对照组20只均表达Rb蛋白。肝硬化组21只中有18只Rb蛋白过表达，阳性率为85.7%。肝癌组（未转移）68只中有37只Rb蛋白过表达，阳性率为54.4%。肝癌组（伴转移）18只中有3只Rb蛋白过表达，阳性率为16.7%。肝硬化组和肝癌组的Rb蛋白表达均低于正常组，而肝癌组的Rb蛋白表达又低于肝硬化组，见表2。
表2 Rb蛋白在不同病变肝组织中的表达（略）
四组间比较，χ2＝34.416，P＝0.000
Rb蛋白阳性产物呈棕黄色或棕褐色，定位在细胞核。Rb蛋白在正常的肝细胞呈阳性表达，而在肝硬化及肿瘤组织中Rb蛋白均有不同程度的失表达。在诱癌过程中，Rb蛋白的阳性表达率随病变程度的加重而逐渐降低，四组间相差非常显著(P&<0.01)。其中肝硬化组表达稍低，与对照组无显著差异(P&>0.05)，而未转移肝癌组与肝硬化组有非常显著差异(P&<0.01)，伴转移肝癌组中的表达率最低，与未转移肝癌组相比差异非常显著(P&<0.01)。见表2、图1、图2。
图1 Rb蛋白在不同病变肝组织中的表达（略）
图2 Rb蛋白在不同病变肝组织中的表达情况（IHC，SP法）（略）
A：正常肝组织；B：肝硬化；C：肝癌(未转移)；D：肝癌(伴转移)
3 讨论
目前，人们对Rb基因及其表达产物Rb蛋白的了解日趋成熟。但做为与细胞周期相关的抑癌基因，其在肝细胞癌(HCC)发生发展中的抑癌机制尚未完全阐明，Rb蛋白在HCC发病机制中与肝细胞凋亡的关系远未明确［6］。Rb基因广泛存在于各组织中，抑制细胞增殖，促进细胞分化，在去磷酸化状态下作用于G1期，阻止G1期向S期转化［7，8］。Rb基因编码一个105Kda的功能性蛋白，位于细胞核内，Rb蛋白是一个广泛性的肿瘤抑制蛋白，其家族蛋白还包括p107、p130，有一个“口袋”结构域，包含A和B两个功能区，中间被一段间隔区隔开，它们相互作用，形成一个转录抑制基序［9］。Rb蛋白的磷酸化降解与多种恶性肿瘤的发生、发展或预后相关［10］。
本研究结果显示Rb蛋白在正常的肝细胞全部呈阳性表达，而在肝硬化及肿瘤组织中Rb蛋白均有不同程度的失表达，Rb蛋白的阳性表达率随病变程度的加重而逐渐降低，四组间相差非常显著(P&<0.01)，这也辅证了Rb蛋白在肝细胞癌形成过程中可能发挥抑癌作用，Rb蛋白的失活可能促进肝细胞癌形成、发生、发展。Rb蛋白在伴转移肝癌组、未转移肝癌组和肝硬化组中的阳性表达率分别是16.7%(3/18)、54.4%(37/68) 和85.7%(18/21)，相差非常显著(P&<0.01)，这表明Rb蛋白的失活与肝癌的发生、发展、转移密切相关，支持Rb蛋白功能缺失主要出现于HCC进展期。
值得注意的是，Rb蛋白在伴转移肝癌组中的表达率为16.7%(3/18)，与未转移肝癌组相比，有显著差异(P&<0.05)，这证实了其可能促进了肝癌的转移和高侵袭性发展，Rb蛋白有可能成为肝细胞癌转移早期监测的参考指标，至于Rb蛋白参与肝癌转移的具体机制有待于进一步深入研究。相信随着对Rb蛋白研究的深入，必将揭开它在肝癌转移中的作用机制，而且它也有望成为肿瘤生物治疗的一个预后判断的有价值的生物学指标。
参考文献
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