【摘要】 目的 连续动态观察氧应激、脂质过氧化及凋亡肝细胞在非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic fatty liver disease ，NAFLD)大鼠模型中的表达情况，从而揭示其在非酒精性脂肪肝病发生及进展过程中的作用及几者的相互关系。方法 取雄性SD大鼠40只随机分为2组：正常对照组10只，给予基础饲料；造模组3O只，给予88％基础饲料+1O％猪油+2％胆固醇，均正常饮水。对照组大鼠于8周后处死。造模组分别于8，12，16周处死，取肝组织标本，制备石蜡切片，行苏木精一伊红（HE） 染色观察肝组织光镜下的病理改变，苦味酸染色观察肝脏纤维化程度；测定各组大鼠超氧化物歧化酶（SOD）活力和丙二醛（MDA）含量；用TUNEL法检测肝细胞凋亡。采用多元线性回归分析评估氧应激、脂质过氧化及肝细胞凋亡在NAFLD中的作用及几者的相关性。P&<0.05有统计学意义。结果 (1)随造模时间延长，造模组大鼠肝组织脂肪变、炎症程度逐渐加重，后期出现少数纤维化表现（P&<0.05）；(2)造模组大鼠血清SOD活性逐渐降低，MDA含量逐渐升高，且SOD活性与肝组织脂变、炎症程度呈负相关（r=-0.726， -0.828;P&<0.01），而MDA含量与肝组织脂变、炎症和纤维化程度程度呈正相关（r=0.876， 0.931， 0.420; P&<0.01）；(3)实验大鼠肝细胞凋亡程度与肝组织脂变、炎症程度呈正相关，与纤维化程度相关(r=0.843， 0.922， 0.662;P&<0.01）；(4)氧应激、脂质过氧化程度与肝细胞凋亡程度亦存在明显相关性(r=-0.700， 0.885;P&<0.01）。结论 在非酒精性脂肪肝病大鼠模型中，氧应激、脂质过氧化及肝细胞凋亡程度与肝损伤程度密切相关；而且氧应激、脂质过氧化与肝细胞凋亡之间联系紧密且相关，氧应激、脂质过氧化可能是非酒精性脂肪肝病中诱导肝细胞凋亡的首要因素。
【关键词】 非酒精性脂肪肝病；氧应激；脂质过氧化；细胞凋亡
ABSTRACTObjective To study the effect of oxidative stress， lipid peroxidation and hepatocellular apoptosis on the incidence and development of non-alcoholic fatty liver disease and to reveal their interrelation. Methods 40 male SD rats were randomly pided into 2 groups: the control group (n=10) and the model group (n=30); the control group was assigned to basic diet while the diet for the model group consisted of 80% of basic diet， 10% of lard and 2% of cholesterol; both groups had normal water-drinking; The rats in the control group were killed in the 8th week and those in the model group were killed in the 8th， 12th and 16th week in batches; the liver tissue samples were collected and paraffin sections were prepared; hematoxylin-eosin staining (HE) was applied to the sections to observe the pathological changes with light microscope and picric acid staining was applied to observe the hepatic fibrosis level. The activity of superoxides mismutase (SOD) and the content of malondialdehyde (MDA) of the rats in both groups were determinated; hepatocellular apoptosis was detected by TUNEL. Multiple linear regression analysis was made to study the effect of oxidative stress， lipid peroxidation and hepatocellular apoptosis on non-alcoholic fatty liver disease and to reveal the interrelation of them; the analysis would be of statistical significance when Ｐ＜0.05. Results 1. With the extension of experimental time， the fatty change and inflammation of the liver tissues of the rats in the model group aggravated gradually， and then a spot of fibrosis were observed (Ｐ＜0.05); 2. The activity of serum superoxide dismutase ( SOD) in the model group decreased gradually while the content of malondialdehyde (MDA) increased gradually; the SOD activity was negatively correlated to liver fatty change and inflammation (r =- 0.726， -0.828; P &<0.01) while the content of MDA was positively correlated to liver fatty change， inflammation and fibrosis level (r = 0.876， 0.931 ， 0.420; P＜0.01); 3. The hepatocellular apoptosis level of the rats in the model group was positively correlated to the fatty change and inflammation of the liver tissues and had certain association with the hepatic fibrosis level (r=0.843， 0.922， 0.662， Ｐ＜0.01 ); 4. There existed an obvious correlation among oxidative stress、lipid peroxidation and hepatocellular apoptosis level (r=-0.700， 0.885; Ｐ＜0.01). Conclusions In the model of rats with non-alcoholic fatty liver disease， oxidative stress， lipid peroxidation and hepatocellular apoptosis have a close relation with the level of liver damage， and they have a close interrelation; oxidative stress and lipid peroxidation are possibly the primary factor in inducing hepatocellular apoptosis in non-alcoholic fatty liver disease.
KEYWORDS non-alcoholic fatty liver disease oxidative stress lipid peroxidation apoptosis
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是一种无过量饮酒史(酒精摄入量＜20g/d［1］，以肝细胞脂肪变性和脂质贮积为特征的临床病理综合征，目前已成为肝功能异常最常见的病因之一，其发病机制尚未完全明确，多种因素与其发生发展相关，目前认为主要包括有胰岛素抵抗、氧自由基的作用、炎症作用、库普弗细胞与细胞因子、脂代谢紊乱、铁超载等。近年来研究发现，氧应激、脂质过氧化及肝细胞凋亡可能在NAFLD肝细胞损伤过程中起首要作用。有流行病学表明，肥胖是引起FLD的主要因素［2］，本实验中通过高脂饮食建立NAFLD大鼠模型，在病情进展过程中选择多个时间点，通过检测SOD活力和MDA含量连续动态观察氧应激、脂质过氧化变化情况；同时通过TUNEL法检测肝细胞凋亡水平，并对肝组织行病理学检测，探讨氧应激、脂质过氧化及肝细胞凋亡在非酒精性脂肪肝病进展过程中的表达情况、作用及相互关系。
1 材料与方法
1.1 实验动物 雄性SD大鼠40只，体重约180-220克/只，购于重庆腾鑫生物技术有限公司。
1.2 实验试剂 TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒购于德国罗氏公司；SOD和MDA测试盒购于南京建成生物工程研究所；胆固醇购于重庆腾鑫生物技术有限公司；食用猪油购于超市。
1.3 实验仪器 美国全波长紫外分光光度计、日本OLYMPUS倒置相差显微镜、德国5415D离心机、SAYYO超低温冰箱、德国Leica-RM2035轮转式切片机。
1.4 建立模型 对照组10只用基础饲料喂养；造模组30只采用88％基础饲料+１0％猪油+2％胆固醇喂养，均自由饮水进食。实验动物饲养于本院生物分子中心实验室，动物房温度保持在18～30℃，通风良好。
1.5 取材 对照组大鼠于8周后处死，造模组分别于8，１2，１6周处死。大鼠处死前，均隔夜禁食，次日以0.2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，心脏采血，于肝右叶中部切取小块肝组织，制备石蜡切片。
1.6 生化指标检测 测定各组大鼠血清SOD活力和MDA含量，以观察大鼠非酒精性脂肪肝病模型氧应激、脂质过氧化程度。SOD采用黄嘌呤氧化物酶法，MDA采用硫代巴比妥酸法，分别于8，１2，１6周进行。
1.7 病理学检查 肝组织石蜡切片、HE染色观察肝组织病理学变化。根据脂滴细胞数所占面积／总细胞数所占面积之比值为0，＜1／3，１／3～2／3和＞2／3分为4级，将肝细胞脂肪变性分为4个等级，达到2级或以上诊断为脂肪肝。炎症活动度积分标准分为汇管区炎症(P)、小叶内炎症(L)、碎屑样坏死(PN)和桥接坏死(BN)4项，每项根据病变程度分别计1～4分，因为碎屑样坏死和桥接坏死严重度与预后直接相关，计分公式为P+L+2PN+2BN。VG苦味酸染色观察肝脏纤维化程度。
对肝组织石蜡切片行TUNEL检测、免疫组化染色。分别每片取10个高倍镜(10×40)视野，读取阳性细胞数，取其平均值。
1.8 统计学处理 所有数据均使用SPSS14.0软件进行统计学分析。计量资料用均数±标准差（x±S）表示，进行方差齐性检验，方差齐者采用单因素方差分析，方差不齐者采用H检验，比较模型组与对照组及模型组间在血清学、病理学及细胞凋亡程度上的差别；计数资料采用χ２检验；采用多元线性回归分析评估肝组织病理学改变与氧化应激程度及肝细胞凋亡的相关性。P&<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 模型建立（见表1） 实验过程中未发生大鼠死亡，40只实验大鼠均进入结果分析。光镜下观察，对照组肝组织细胞形态正常，无变性、坏死、炎细胞浸润及纤维组织增生；造模组肝组织随时间延长，呈轻度-重度脂肪变性，后期呈弥漫性，经χ２检验P&<0.01，有统计学意义；各造模组炎症程度逐步加重，可见程度不等的小叶内炎症、汇管区炎症、汇管区变性及点状坏死或坏死灶，炎症细胞以单核细胞、淋巴细胞浸润为主，也有一些中性粒细胞，因方差不齐，行H检验，造模组8、12、16周3个时间点的炎症活动度评分均高于对照组，差异有非常显著性意义(P&<0.01)， 造模组间比较亦差异明显（P&<0.05）。
肝组织行HE染色后镜下观察显示，造模8周大鼠未见肝组织纤维化，造模12周1／10大鼠出现少数肝细胞窦周纤维化，中央静脉周围和汇管区较少，造模１6周时4／10只大鼠出现少数纤维化，但纤维化程度均较轻微，行χ２检验（P&<0.05，P=0.025），存在差异。
表1 两组动物肝组织病理改变（略）
注：肝组织炎症活动度:与正常对照组比较aP&<0.01；造模组12周与造模组8周比较bP&<0.05；造模组16周与造模组12周比较cP&<0.01
2.2 实验大鼠氧应激、脂质过氧化程度及肝细胞凋亡的表达（见表2） SOD活性在造模组中呈进行性下降，行方差分析，造模组各时间段SOD值均低于对照组，其中以8周、12周最为明显，且造模组间比较也存在明显差异（P&<0.01）；随SOD活性下降，各组大鼠血清MDA含量逐步升高，其中造模各组与对照组比较差异明显（P&<0.01），造模组间比较以16周升高较明显，8周、12周间差异较小。
各组肝组织行免疫组化TUNEL检测， TUNEL染色阳性定位于细胞核，强阳性染色才被认为是凋亡。光镜下观察，对照组大鼠肝组织中TUNEL染色阳性肝细胞较少见，散在分布于中央静脉周围；造模组随造模时间延长， TUNEL染色阳性的凋亡细胞数逐步增多，发生凋亡的肝细胞常位于脂肪变、炎症细胞浸润严重以及纤维化区域附近。因方差不齐，行H检验，各造模组明显高于对照组（P&<0.01），造模组间比较，以12周升高最为明显（P&<0.01），12周与8周间差异较大，而12周、16周间差异较小（P&>0.05）。
表2 两组动物SOD活性、MDA含量及肝细胞凋亡的表达情况（略）
注：与正常对照组比较aP&<0.01；造模组12周与造模组8周比较bP&<0.01；造模组16周与造模组12周比较cP&<0.01
2.3 实验大鼠氧应激、脂质过氧化程度及肝细胞凋亡对肝组织病理改变的影响（见表3） 。行多元线性回归分析表明：SOD活性与肝脂肪变性程度、炎症活动度呈负相关（R=-0.726，-0.828，P&<0.05）；MDA含量、TUNEL染色阳性细胞均与肝脂肪变性程度、炎症活动度及纤维化程度呈正相关（P&<0.05）；SOD活性与肝组织纤维化程度无相关（R=-0.194，P=0.230）。以上结果说明氧应激、脂质过氧化及肝细胞凋亡是引起NAFLD中脂肪变性和炎症的重要因素，而且凋亡肝细胞与肝组织纤维化程度关系密切。
表3 氧应激、脂质过氧化程度及肝细胞凋亡与肝组织病理改变的相关性（略）
2.4 实验大鼠氧应激、脂质过氧化程度及肝细胞凋亡的相关性。通过多元线性回归分析显示：氧应激、脂质过氧化是引起肝细胞凋亡的重要因素，且关系密切，SOD活性与肝细胞凋亡水平呈负相关（R=-0.700，P&<0.01）；MDA含量与肝细胞凋亡水平呈正相关（R=0.885，P&<0.01）。
3 讨论
3.1 氧应激、脂质过氧化对NAFLD的作用 非酒精性脂肪肝病(NAFLD)目前已成为导致无症状性转氨酶升高的首要病因［3］，后期可进展为肝硬化，甚至某些肝脏肿瘤而危及生命，其发病率呈上升趋势，发病机制目前尚未完全明确，诸多因素被认为与之相关。1998年Day等［4］学者对脂肪性肝病(FLD)的发病机制提出统一的“二次打击”学说，即初次打击主要是胰岛素抵抗和脂质代谢紊乱，导致肝细胞脂肪变性，但由于适应性反应机制等防御功能与之抗衡，大多数单纯性脂肪肝的功能和结构改变可逆；第二次打击主要是各种原因所致的氧应激和脂质过氧化损伤，导致炎性细胞因子释放增多，多种物质表达增强（或被激活），肝细胞发生炎症、坏死或凋亡，使病程向脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化发展。而近年来对NAFLD的观察表明，氧应激在其早期可能已存在致病作用［1］ ，因此氧应激、脂质过氧化被认为可能是导致NAFLD并促其发展的最主要因素之一，也成为众多学者研究的重点。
在本实验中，应用高脂饮食诱导建立非酒精性脂肪肝病大鼠模型，通过病理观察，证实模型建立成功，脂肪变性、炎症及纤维化存在，并观察到病情的进展过程。超氧化物歧化酶是体内十分重要的抗氧化酶，其本质是一种生物活性蛋白质，这种酶具有清除新陈代谢中产生的活性氧中的超氧阴离子自由基的能力，在维护机体活性氧代谢的平衡中起重要作用，是机体抗氧化防御系统的重要成员。丙二醛是自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸而引发的脂质过氧化作用的最终分解产物，其含量水平可反映机体内细胞脂质过氧化的程度。
此次试验中，通过在造模不同阶段测定血清中SOD活性和MDA含量而反应此时机体氧应激、脂质过氧化水平。实验结果表明，各阶段造模组SOD活性明显低于对照组，同时MDA含量明显高于对照组（P&<0.05），说明氧应激、脂质过氧化与NAFLD的发病存在某种联系，与国内外某些文献报道一致［5，6］，其具体机制未完全明确，目前有研究认为，在NAFLD的发病过程中，在细胞色素（Cyt）等因素作用下，释放大量的活性氧和自由基，自由基生成增多不但氧化细胞膜的脂质，更重要的是氧化细胞膜的蛋白质，最终导致肝细胞结构与功能的损害［7］；脂质过氧化的终产物MDA的半衰期较活性氧（ROS）长，且能弥散到细胞内、外其他靶位，扩大氧应激的损害，而且MDA能与蛋白质结合，形成复合物，从而激活机体的免疫反应而参与肝损害，诱导细胞死亡、炎症和纤维化［8］；氧化应激过程可激活库普弗（Kupfer）细胞，激活后的Kupfer细胞可产生一系列可溶性细胞因子，可损伤肝内皮细胞，增强中性粒细胞及单核细胞产生活性氧介质的能力，释放氧自由基，致脂质过氧化，进一步加重肝损伤，还可诱导肝细胞线粒体解偶联蛋白(UCP2)基因表达，导致肝细胞坏死增多；另外氧应激还可启动肝星状细胞（HSC）的活化，其过程主要通过ROS的作用和(或)脂质过氧化反应性醛类产物的作用，如MDA和壬烯(HNE)［9］，而HSC是导致肝纤维化的主要细胞。
同时该实验通过选用多个不同时间段对NAFLD病情变化进行连续性动态观察，发现造模组间SOD活性及MDA含量比较也存在显著差异（P&<0.05），说明氧应激、脂质过氧化水平随NAFLD病情发展呈进行性改变。通过多元相关分析，表明SOD活性与脂肪变性程度负相关（R=-0.726，P&<0.01），与炎症程度负相关（R=-0.828，P&<0.01）；MDA含量与脂肪变性程度正相关（R=0.876，P=&<0.01），与炎症程度正相关（R=0.931，P&<0.01），与纤维化程度正相关（R=0.420，P&<0.01），SOD活性与纤维化程度无相关（P=0.230）可能由实验样本少引起。以上更进一步表明氧应激、脂质过氧化与NAFLD关系密切，是导致其病情发生发展的重要因素。
3.2 细胞凋亡对NAFLD的作用 细胞凋亡是由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞主动性死亡方式，在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。对肝脏而言，生理状况下的细胞凋亡可以消除衰老的细胞，清除受损伤或有癌前病变的细胞从而调节正常肝细胞数量，维持肝脏正常体积；但病理条件下的肝细胞凋亡参与严重疾病发生，酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、病毒性肝炎、肝癌等肝病的发病机制均已证明与肝细胞凋亡有密切关系［10］ 。
实验中发现，在非酒精性脂肪肝病模型中，肝细胞凋亡数呈增多趋势，造模组与对照组及组间比较均存在显著差异（P&<0.01），其程度随NAFLD病情进展而加重，与脂肪变性程度正相关（R=0.843，P&<0.01），与炎症程度正相关（R=0.922，P&<0.01），与纤维化程度正相关（R=0.439，P&<0.01），表明凋亡可能在非酒精性脂肪性肝病进展中起重要的作用。过去多数研究认为，凋亡细胞周围由于吞噬细胞吞噬凋亡小体而无炎症渗出，而Lawson［11］和Jaeschke［12］等通过各自研究却发现，凋亡可引发中性粒细胞渗透至肝并且转移至软组织，炎症为肝实质细胞凋亡的一种反应。该实验则通过连续性观察，表明连续的肝细胞凋亡可能调节炎症，甚至纤维化进程。
3.3 氧应激、脂质过氧化对肝细胞凋亡的影响 细胞凋亡的具体机制尚不明确，可能与氧化损伤、钙稳态失衡、线粒体的损伤等多个因素有关，是多重作用的结果，同时它也是多基因严格控制的过程，这些基因在种属之间非常保守，如Bcl2 家族、caspase 家族、癌基因如Cmyc、抑癌基因P53 等。目前研究认为细胞凋亡主要由外通路(死亡受体通路)和内通路(线粒体通路)两条通路传导，多因素共同作用导致细胞凋亡，其中自由基损伤学说是较重要的假说之一［13］，其具体分子机制不完全明确，可能与多种因素有关，如ROS可活化NF—KB并诱导NF—KB表达；损伤DNA，激活P53诱导细胞凋亡等。而近年来研究发现，ROS可通过多种途径导致线粒体功能障碍，导致位于线粒体内膜与外膜接触位点的通透性转变孔道(PTP) 在病理情况下开放，使细胞色素C和凋亡诱导因子释放到胞浆，活化半胱氨酸蛋白酶3(caspase3)，引起瀑布式级联反应，诱导细胞凋亡的发生，此途径可能是导致细胞凋亡的最主要方式。本实验中，通过大鼠模型观察非酒精性脂肪肝病进展过程中肝细胞凋亡情况，发现SOD活性与肝细胞凋亡程度呈负相关（R=-0.700，P&<0.01），同时MDA含量与肝细胞凋亡程度呈正相关（R=0.885，P&<0.01），由此说明在非酒精性脂肪肝病中氧应激、脂质过氧化程度与肝细胞凋亡存在明显的相关性。
综上所述，氧应激、脂质过氧化及肝细胞凋亡程度与非酒精性脂肪肝病中肝损伤程度密切相关，同时，氧应激、脂质过氧化与肝细胞凋亡之间联系紧密，氧化应激可能是导致肝细胞凋亡的直接原因。几者之间的机制联系对治疗此疾病提供了更多的空间，如同抗肿瘤坏死因子a已成功用于治疗严重的酒精性肝病一样，阻碍氧化应激、抗凋亡治疗也可能将成为对抗脂肪变性和肝纤维化、治疗非酒精性脂肪肝病的重要方法之一。
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