外科缺血再灌注过程中的线粒体损伤

　　　　作者：骆助林，权毅，潘显明，屈波

【关键词】 外科；缺血再灌注损伤；线粒体损伤

　　缺血再灌注损伤是一种外科的基本病理变化，见于许多外科疾病的过程，如冠状动脉的再通，器官移植，断指断肢再植，手术过程中人为的阻断血供等情况。再灌注损伤过程中，一系列的级联反应介导了细胞结构严重损伤，包括能量代谢的衰竭，Ca2+离子稳态改变，活性氧簇的产生。外科过程中的缺血再灌注损伤影响到患者的近期和远期生存率［１］，线粒体在细胞能量代谢中处于中枢地位，参与细胞内钙的调节，形成氧自由基并产生活性氧，控制细胞死亡，促进在机体中的缺血再灌注损伤。

　　1 线粒体的结构和生理
　　
　　线粒体有内膜和外膜两层膜结构，两层膜中间为膜间腔，内膜内侧为基质。线粒体外膜通透性较高，内膜对各种物质的通过性有严格的选择性，几乎所有的离子和不带电荷的小分子化合物都不能自由的通过。由于线粒体内膜对离子通透性的严格限制，结果是基质内充满了高选择性的分子。电化学梯度的存在是维持线粒体产生ATP的基础，氧化剂和抗氧化剂形成的稳定平衡是一些生物过程所必须的，比如维持Ca2＋循环、酶的活性、信号转导途径和基因转录的调节［2］。
　　
　　在生理条件下，每分子O2在复合体Ⅳ的水平被4个电子还原（四价还原），但仍然有约2%-4%的氧只能得到单个的从电子传递链上复合体漏出的电子（单价还原），形成活性氧簇（ROS）。这种少量产生ROS是保持氧化还原状态所必须的，对基因的活性，Ca2+循环以及维持许多酶的功能非常重要。

　　２ 缺血期的损伤

　　2.1 相关蛋白质的损伤 长时间的缺血能改变电子传递链上复合体，60分钟的缺血后，所有的复合体亚基结构损伤，活性下降，复合体Ⅰ和复合体Ⅲ表现的对缺血损伤更敏感。随着脂酰辅酶A的累积，腺苷酸载体减少。Tsunekawa等在大鼠冷缺血中发现复合体Ⅴ分子损伤，损伤的复合体变得更加易于电子逸出，这些可能导致再灌注期的一系列损伤［3］。

　　2.2 ATP下降 缺血期组织或器官的血流阻断使细胞供氧明显减少，从而导致细胞低氧和氧化磷酸化抑制，细胞内ＡＴＰ浓度快速下降。为了保持线粒体完整性，线粒体内的ATP合酶水解ATP以保持线粒体跨膜电位［4］。ATP水解导致游离的磷酸盐升高，促使内膜通透性增加，缺血时间延长导致位于复合体Ⅰ和复合体Ⅱ中的铁硫蛋白的退化，引起二价铁离子Fe2+的释放，在再灌注期参与ROS的形成［5］。

　　2.3 抗氧化剂的减少 缺血也导致线粒体抗氧化系统的降低，并且使细胞对氧化作用更加敏感。在缺血期线粒体的谷胱甘肽酶类，例如谷胱甘肽过氧化物酶的活性还比较稳定，然而Arduini等证明线粒体超氧化物歧化酶在缺血期活性明显下降，另一些人的研究也发现大鼠线粒体的GSH水平在冷缺血和冷保存期间明显下降［6］。

　　2.4 内膜通透性升高 在缺血期，Na＋/K＋泵被抑制，导致细胞内Na＋水平升高，引起细胞内Ca2+升高，进而内膜通透性升高［2］。

　　３ 再灌注期损伤

　　3.1 氧化剂的增加 在缺血期，线粒体产生活性氧起着重要的作用。当细胞再次有氧输入时，线粒体电子传递链大量产生O2。－。随着再灌注时氧的再次输入，电子传递链上复合体被损伤，电子逸出，产生大量O2。－，被称为“氧爆发”［7］。GonzalezFlecha等在缺血再灌注试验证明线粒体在活性氧产生中扮演了一个重要角色，在肝缺血再灌注模型中，用电子传递链特异性抑制体证明线粒体是产生过氧化氢的主要部位［8］。线粒体孤立的暴露于缺氧和氧再合时，随着对线粒体蛋白质的氧化损伤，呼吸功能明显下降，并检测出脂质过氧化反应的标记丙二醛。缺氧/再氧合后将线粒体与与抗氧化剂一起孵化，能明显改善线粒体呼吸功能。

　　3.2 抗氧化系统的失活　在长时间缺血的条件下，抗氧化剂系统没有能力应对ROS的增加。由于MnSOD缺乏活性大量过氧化物的产生时能产生有效的氧化因子，如过氧化亚硝酸盐，是由过氧化物与线粒体NO反应产生，而NO通过影响cGMP信号系统，阻滞Ca2+通道，维持线粒体内膜通透性［9］，NO消耗促进内膜通透性增加。GSH的缺乏导致h3O2累积，在铁的催化下促进羟基生成。在大鼠肝移植中，冷保存后的大鼠肝脏再灌注30分钟后检测到GSH下降，线粒体羟基过氧化物酶升高， GSH的耗竭影响到ATP的产生，内膜的稳定性和细胞存活［10］。

　　3.3 电子传递链复合体的氧化损伤 急性氧化应激抑制线粒体呼吸功能，随之产生的ROS（特别是羟基和过氧化亚硝酸盐）损伤蛋白质，脂质，DNA等线粒体内外结构。线粒体电子传递链复合体的损伤进一步抑制ATP的产生，使之形成蛋白－蛋白胶联，促使电子逸出［11］。ROS和脂类的反应产物更进一步损害线粒体内膜稳定性，更增加了电子传递链的损伤和过氧化物的产生。再灌注时过度的Ca2+进入内膜也抑制了氧化磷酸化，增加了内膜通透性。

　　3.4 线粒体DNA（mtDNA）的氧化损伤 线粒体DNA（mtDNA）对氧化损伤特别敏感，因其缺乏组蛋白，而且位于线粒体产生ROS的电子传递链附近。线粒体DNA缺少修复机制，氧化损伤可决定其死亡还是突变，导致野生型和损伤的mtDNA的累积。mtDNA编码电子传递链的13个亚基，其余的由染色体DNA编码。由于mtDNA没有内含子，任何突变均会影响到其编码区，导致电子传递链上一个或者多个复合体的失活，这将抑制氧化磷酸化作用，电子逸出增多，ROS产生增加，ATP产生减少［11］。慢性的ROS产生增加影响到氧化剂和抗氧化剂的平衡，引起蛋白和脂质的慢性氧化，从而影响到再灌注器官的恢复。

　　４ 线粒体损伤与凋亡
　　
　　在供体器官冷保存和再灌注过程中均观察到细胞凋亡增加［12］。采取保护凋亡的措施，包括抗凋亡蛋白caspases处理，Bcl2基因转染细胞，能明显提高再灌注后的移植器官功能。通常情况下，凋亡通过清除坏死的和过多的细胞来维持组织平衡。也会出现在正常组织中，它由凋亡蛋白caspases介导，并且被凋亡抑制蛋白例如Bcl2家族所抑制，过多的凋亡引起的细胞丢失能导致器官的急性和慢性衰竭。缺血再灌注损伤时线粒体功能改变可引起凋亡。线粒体外膜包含多种Bcl2家族的凋亡调节蛋白，线粒体在缺血再灌注时的变化能促发细胞凋亡。生理条件下Ca2+控制和调节氧化磷酸化，器官再灌注时大量的Ca2+进入基质，开启巨通道，引起线粒体内膜渗透性改变［13］，线粒体内膜渗透性改变导致凋亡诱导因子的释放，促发细胞凋亡。ROS在缺血再灌注时生成增多，引起凋亡增加，而凋亡也促进起线粒体内ROS的生成，进一步导致组织缺血再灌注损伤。

　　5 线粒体损伤程度的指标
　　
　　评价线粒体呼吸活性常用呼吸控制率(RCR)和磷氧比(P/O)来表示。它们是反映线粒体完整性、氧化磷酸化偶联程度及氧化磷酸化效率的灵敏指标。肝脏缺血再灌注时线粒体通透性的改变、线粒体内酶和辅酶的丢失，以及由此造成的氧化磷酸化障碍，均可影响线粒体呼吸活性。
　　
　　线粒体在组织器官缺血再灌注过程处于关键部位，外科疾病过程中的缺血再灌注损伤可以引起线粒体呼吸功能障碍［14］，降低再灌注器官活力，影响其近期和远期生存率。线粒体的离子平衡、氧化磷酸化作用、氧化还原反应和物理形态是线粒体在缺血再灌注损伤中的关键，了解机体缺血再灌注中线粒体变化的机制，有助于采取措施，减少组织器官缺血再灌注过程中线粒体的损伤，提高手术成功率。

参考文献

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