RGS4在HUEVCs凋亡中的作用及地塞米松对其的影响

　　　　 作者：陈星云，赵艳，李平，熊仁，刘苹，杨楠，周元国

【摘要】 　　目的 研究RGS4对常氧和低氧培养条件下HUEVC细胞凋亡的影响及地塞米松在其中的作用，以探讨RGS4在HUEVC细胞凋亡中的作用及地塞米松处理对其的影响。方法 采用O2/N2/CO2三气培养箱模拟常氧和低氧条件培养HUEVC细胞，RGS4真核表达载体转染HUEVC细胞后采用流式细胞仪（AnnexinVFITCPI法）检测细胞凋亡。结果 常氧条件下RGS4转染细胞和地塞米松处理对细胞凋亡无明显影响，低氧培养条件下细胞凋亡增加(P&<0.01)，RGS4转染后可使HUEVC细胞凋亡显著减少(P&<0.01)，地塞米松和RGS4同时处理后HUEVC细胞的凋亡与单纯RGS4转染无显著差别。结论 RGS4不影响常氧条件下的HUEVC细胞凋亡，但可明显抑制低氧条件下的HUEVC细胞凋亡，地塞米松抑制细胞凋亡的作用可能与RGS4有关或者通过相同的细胞信号通路抑制低氧条件下的细胞凋亡。

【关键词】 细胞凋亡 地塞米松 RGS4

　　Abstract Objective To study the role of RGS4 in apoptosis of HUEVCs in normoxia or hypoxia and the effect of dexamethasone on it.Methods HUEVCs were cultured in the simulated normoxia or hypoxia of O2/N2/CO2 cell incubator and were transfected with the eukaryotic expression vector of RGS4; the flow cytometer (Annexin-V-FITC-PI) was applied to detect its apoptosis. Results The transfection of RGS4 and treatment of dexamethasone had no obvious effect on the apoptosis in normoxia while the apoptosis of HUEVCs increased in hypoxia (P&<0.01); the apoptosis of HUEVCs decreased significantly after RGS4 transfection (P&<0.01); the apoptosis of HUEVCs treated with dexamethasone and with RGS4 at the same time showed no obvious difference from that treated with RGS4 transfection only. Conclusions RGS4 has no effect on the apoptosis of HUEVCs in normoxia but it can inhibit the apoptosis of HUEVCs in hypoxia; the effect of dexamethasone on the apoptosis of HUEVCs is probably related to RGS4， or RGS4 and dexamethasone employ the same cell signaling pathway when inhibiting the apoptosis of HUEVCsw.

　　Keywords apoptosis　　 dexamethasone　　 RGS4

　　急性肺损伤是肺脏炎症和肺微血管通透性增加的急性、进行性呼吸衰竭，其最终阶段即急性呼吸窘迫综合征。血管内皮细胞是连续性衬在血管腔内面，参与体内许多生理和病理生理过程，如维持血管完整性、分泌和释放活性物质、维持血管张力等。在急性肺损伤过程中，肺微血管的变化尤为引人注目，内皮细胞受损被认为是急性肺损伤发生、发展的病理基础。国内外多项研究表明［1～4］，急性肺损伤时内皮细胞发生凋亡，从而导致肺血管内皮－上皮屏障受到破坏，导致血管通透性增加，引起肺水肿和气体交换障碍，地塞米松可以抑制血管内皮细胞的凋亡［6，7］，减轻肺损伤。
　　
　　本研究拟采用HUEVC内皮细胞株，采用常氧和低氧培养，观察RGS4表达质粒转染后皮细胞凋亡和地塞米松处理后内皮细胞凋亡的变化，以阐明RGS4在内皮细胞凋亡中的作用以及地塞米松处理对其的影响。

　　1 资料与方法

　　1.1 主要试剂 质粒：RGS4 in pcDNA3.1(+)(RGS0400000，GUTHRIE cDNA Resource Center，美国)，pcDNA3.1(+)，质粒大量抽提试剂盒(E.Z.N.A. Plasmid Maxiprep Kit， Omega)，Lifofectamin Plus TM Reagent(Invitrogen，美国)。

　　1.2 实验分组及指标检测时相点 （1）常氧实验分组：1) 空白对照组：(control N1)；2) pcDNA3.1(+)组：(转染pcDNA3.1(+)空质粒，cotrol N2)；3) RGS4转染组：(转染RGS4表达质粒，RGS4N)；4)RGS4转染＋地塞米松处理组(RGS4＋DEX N)；（2）低氧实验分组(1％O2／5％CO2／94 N2％)：1) 空白对照组：(control H1)；2) pcDNA3.1(+)组：(转染pcDNA3.1(+)空质粒，cotrol h3)；3) RGS4转染组：(转染RGS4表达质粒，RGS4H)；4) RGS4转染＋地塞米松处理组(10－7M )(RGS4＋DEX H)（3）检测时相点：流式细胞仪检测细胞凋亡分别于低氧处理后6小时、24小时和48小时测定。

　　1.3 RGS4以及pcDNA3.1(+)质粒的扩增与提取 常规方法扩增RGS4与pcDNA3.1(+)质粒并采用质粒提取试剂盒提取质粒以用于转染

　　1.4 HUEVC细胞的培养 取液氮中冻存的HUEVC细胞株，迅速放入40℃水浴中，快速溶解细胞。超净工作台内将细胞悬液移入离涯管中，滴加DMEM培养基至8毫升，洗涤细胞。2000转、离心5分钟、弃上清，用DEME再次洗涤沉淀。沉淀用DEME培养基＋小牛血清悬浮+3%内皮细胞生长因子，移入到细胞培养瓶中培养备用。

　　1.5 质粒转染(Lipofectamine plus法) 细胞接种，6孔板常规接种2×105细胞/每孔；待细胞贴壁，长至培养板的60%～70％开始转染；质粒转染按Lipofectamine plus 说明书进行。转染24小时后加入G418筛选(1000μg/ml)，直至筛选出可稳定表达的阳性细胞克隆。

　　1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡

　　1.6.1 在细胞培养瓶内培养未转染细胞和质粒转染后筛选出的阳性细胞克隆。待长满后加入0.25%胰酶500μl，消化9分钟后抽出胰酶，加入1ml培养基终止消化，吹打细胞使之脱壁，然后用培养基稀释到5×105，接种到6孔培养板上培养(质粒转染组维持G418浓度为500μg/ml)。待长满70％左右时，地塞米松组分别加入10－7M的DEX，其余组不加任何因素，分别置于常氧培养箱和低氧培养箱内培养，分别于6小时、24小时和48小时检测细胞凋亡情况。

　　1.6.2 细胞凋亡的检测 采用AnnexinVFITCPI 法检测： 取6孔板上培养的细胞，0.25%胰酶500μl，消化9分钟后抽出胰酶，加入1ml培养基终止消化，吹打细胞成细胞悬液。2000转4℃离心5分钟，弃上清。4℃预冷的PBS洗涤细胞，2000转4℃离心5分钟后弃上清，再次悬浮离心。加5μl AnnexinVFITC溶液和2.5μl PI到100μl细胞悬浮液中，混匀后避光反应10分钟，计入150μl样品稀释液到样品中，混匀后上机检测。

　　1.7 数据分析及统计方法 本实验数据均以均值±标准差(±SD)表示，统计分析和统计作图分别采用sigmastat与sigmaplot进行，采用t检验分析，结果以P&<0.05为差异显著，P&<0.01为差异非常显著。

　　2 结果

　　2.1 常氧条件下各组细胞凋亡率的变化 常氧培养条件下，各组细胞间的细胞凋亡率没有显著差异，提示RGS4转染和地塞米松处理对常氧条件下的细胞凋亡无明显影响（见表1)。

　　表1 常氧条件下各组凋亡率的变化(占细胞总数的%，n=4)（略）

　　注：control N1： 空白对照组；control N2：pcDNA3.1(+)组，转染pcDNA3.1(+)空质粒；RGS4N：RGS4转染组，转染RGS4表达质粒；DEX N： RGS4转染＋地塞米松处理组

　　2.2 低氧条件下各组细胞凋亡率的变化 低氧条件下，Control H1和Control h3组间没有显著差别，但是RGS4 H组和DEXH组各时相点的凋亡率均显著低于上述两组(P值均&<0.01)，DEX H组与RGS4组各时相点的细胞凋亡率均无显著差异(P&<0.05)(见表2)。

　　表2 低氧条件下各组凋亡率的变化(占细胞总数的％，n=4)（略）

　　注：control H1： 空白对照组； control h3：pcDNA3.1(+)组，转染pcDNA3.1(+)空质粒；RGS4H：RGS4转染组，转染RGS4表达质粒；DEX H： RGS4转染＋地塞米松处理组.**同Control H1相比P&<0.01，◆◆同Control h3相比P&<0.01，▲▲同RGS4 H相比P&<0.01

　　2.3 常氧和低氧条件下各组细胞凋亡率的差异 ControlH1组和Controlh3组各时相点的细胞凋亡凋亡率显著高于Control N1组和Control N2组（P&<0.01），提示低氧可诱导细胞凋亡。
　　
　　RGS4H组各时相点细胞凋亡率虽显著低于ControlH1组和Controlh3组，但其6小时和24小时的细胞凋亡率仍显著高于RGSN组、ControlN1和Control N2组(P&<0.05)，而48小时的细胞凋亡率则与RGS4N、ControlN1和ControlN2组无显著差异（P&>0.05）DEXH组各时相点的凋亡情况与RGSH组各时相点的凋亡情况类似，即6小时和24小时的凋亡率显著高于DEXN组和ControlN1和Control N2组(P&<0.05)，48小时的细胞凋亡率则与DEXN、ControlN1和ControlN2组无显著差异（P&>0.05）（图1）。

　　图1 常氧和低氧条件下各组细胞凋亡率的差异（略）

　　control N1： 空白对照组； control N2：pcDNA3.1(+)组，转染pcDNA3.1(+)空质粒；

　　RGS4N：RGS4转染组，转染RGS4表达质粒；DEX N： RGS4转染＋地塞米松处理组。

　　control H1： 空白对照组； control h3：pcDNA3.1(+)组，转染pcDNA3.1(+)空质粒；

　　RGS4H：RGS4转染组，转染RGS4表达质粒；DEX H： RGS4转染＋地塞米松处理组。

　　注：*同controlN1相比，P&<0.01；#同controlN2相比，P&<0.01；△同RGSN相比P&<0.05；▲同DEXN相比P&<0.05

　　3 讨论
　　
　　血管内皮细胞是连续性衬在血管腔内面，参与体内许多生理和病理生理过程，如维持血管完整性、分泌和释放活性物质、维持血管张力等。目前认为，血管内皮细胞不仅作为被动的靶细胞，还可通过其屏障和分泌功能而影响急性肺损伤的发生、发展。在急性肺损伤特征性的肺源性水肿中，血管内皮细胞受损是最初的环节。内皮细胞受损导致肺血管内皮上皮屏障渗透性增加，液体、蛋白渗漏到肺泡内，引起气体交换障碍。Petrache I等研究发现，TNFα诱导的肺内皮细胞凋亡的同时，增加肌凝蛋白轻链磷酸化、纤维紧张、细胞周围间隙形成，膜通透性增加。因此可以推测，急性肺损伤早期内皮细胞凋亡是肺血管内皮—上皮屏障通透性增加的原因之一［6］。内毒素可以诱导牛血管内皮细胞凋亡［7］，其机制还不十分清楚，但是有研究发现，一氧化氮可以抑制内毒素诱导的血管内皮细胞凋亡。本研究结果发现，在正常氧分压的情况下，转染RGS4表达载体对内皮细胞的凋亡没有影响，地塞米松处理也没有任何影响。但在低氧条件下，培养的人HUEVC细胞凋亡增加，说明低氧可诱导血管内皮细胞凋亡，转染RGS4表达载体后6小时，细胞凋亡率即有显著降低，提示在低氧条件下RGS4可抑制内皮细胞凋亡。地塞米松处理与单纯RGS4处理后的结果相似，这一结果与Newton等［7］的结果一致，他们的研究发现，地塞米松可以抑制包括TNFα、h3O2和喜树碱等多种因素诱导的细胞凋亡。
　　
　　糖皮质激素经典作用模式为基因组机制，通过调节基因转录发挥作用。但是糖皮质激素还可以通过非基因组机制发挥效应，最近的研究发现，大剂量糖皮质激素治疗减轻心肌梗塞和中风后的血管炎症反应，从而锦轻缺血性组织损伤，这种作用是通过内皮细胞一氧化氮合酶活性的非转录活化实现的［8］。
　　
　　RGS4是G蛋白信号转导的负调节因子，可通过加速GTP水解而抑制Gi/q蛋白的信号转导［9］，对于其与小G蛋白Rho的作用目前报道则相对较少。RGS4和地塞米松均可抑制低氧诱导的细胞凋亡，可能与其内皮细胞一氧化氮合酶活性非转录性激活有关，地塞米松激活内皮细胞一氧化氮合酶，导致一氧化氮合成增加，而研究发现，一氧化氮具有抑制细胞凋亡的作用，一氧化氮通过激活cGMP级联反应防止细胞凋亡。结合于鸟苷酸环化酶辅基血红素的一氧化氮可以增加cGMP的浓度，激活cGMP依赖性激酶(PKG)，或者交叉激活cAMP依赖性激酶(PKA)。一氧化氮合酶是包括PKG或PKA在内多种蛋白激酶的底物。由PKA或PKG引起的磷酸化可能是一氧化氮合酶信号转导途径的反馈机制。研究表明，Rho激酶可通过磷酸化eNOS氨基酸第 495位的苏氨酸抑制内皮细胞中一氧化氮的产生［10］，参与内皮细胞屏障的维持［11］，而ROCK1则在血管损伤过程中发挥重要作用［12］。Rho激酶作为小G蛋白RhoA的下游效应分子，其活化有赖于RhoA对其的作用，RGS4可能通过抑制RhoA的信号转导而抑制Rho激酶对eNOS 495位苏氨酸的磷酸化而发挥生物学效应。我们研究发现，糖皮质激素受体可与RGS4直接作用而发挥eNOS激活效应（待发表资料），而本研究的结果也发现，RGS4可抑制低氧条件下的细胞凋亡，而同时应用地塞米松并不能增强RGS4的这种效应，提示地塞米松和RGS4可能是通过相同的效应分子发挥其抗凋亡作用的。

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