clock基因干扰质粒的构建及干扰效率测定

　　　　 作者：付天明 鲁芳 刘延友 汪宇辉 江舟 甘露 薛建新 邹晏 王正荣

【摘要】 目的：构建clock基因的干扰质粒，为深入研究clock基因在信号转导通路中的作用提供有效手段。方法：采用Mfolder生物软件选择2个clock基因干扰位点，并根据3个干扰片段及一个阴性对照片段，定向克隆到pGenesil1干扰载体并测序验证。将干扰质粒及对照质粒分别转染至NIH3T3细胞，并通过检测RTPCR产物量以获得干扰效率。结果：RTPCR产物检测结果显示干扰质粒pGenesil1/clockⅡ干扰效率最高，其clock表达量降低了74%，而pGenesil1/clockⅠ干扰组clock表达量只降低了2%。结论:成功构建了对clock基因具有显著干扰效率的pGenesil1/clockⅡ干扰质粒，为进一步研究clock基因的功能奠定了基础。

【关键词】 时间生物学；生物节律；干扰质粒；RNA干扰；RTPCR；clock基因

时间生物学（Chronobiology）是当前生命科学的热点领域，其对生物节律的研究以新颖而独特的观点揭示着自然界和人类社会的纷繁现象，并从本质上阐释生命活动的内在规律。自1985年第一个与生物钟相关的基因period从果蝇体内被成功克隆以来，一系列节律基因（Circadian gene）比如clock，rigui，bmal1，timeless，cry，frq，vvd，noc，kai等被陆续发现[1-7]。他们在许多基本生物功能，包括体温[8]、呼吸[9]、睡眠[10]、进食[11]、血压[12]、血糖、内分泌[13，14]等诸多稳态中发挥着关键作用，构成生物节律的固有物质基础。clock基因作为调控生物节律现象的核心基因之一，对维持正常的近日节律（Circadian rhythm）起着关键作用[15]。目前与clock基因功能相关的研究在不断继续，而至从RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术问世以来，它已经成为一项非常特异、高效的工具被广泛应用于各种基因功能的研究中。RNA干扰本来是指外源和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因mRNA特异性降解，从而导致转录后基因沉默的现象，而在功能基因组学与疾病基因组学领域，生物学家则利用RNA干扰技术特异性剔除或关闭目的基因的表达，从而研究目的基因的功能和特性[16，17]。

　　本文旨在构建针对clock基因的高效干扰质粒，从而实现clock基因在细胞水平和整体动物水平的表达抑制，为我们深入研究clock基因在信号转导通路中的作用提供有效帮助。

1 材料与方法

　　1.1 材料

　　MEM培养基购自Gibco公司，新生小牛血清购自Hyclone，胰蛋白酶购自Gibco公司。35mm培养皿、多孔细胞培养板购自Corning Incorporated。Lipofectamine 2000阳离子脂质体和TRIzol试剂均购自Invitrogen公司，HindⅢ、BamHⅠ酶、DNA连接试剂盒和RTPCR检测试剂盒以及SYBR Prime Script RTPCR Kit试剂盒购自TaKaRa公司。质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自Omega公司。RPMI Medium 1640培养基购自Gibco公司。Fugene6转染试剂购自罗氏公司。小鼠肺成纤维细胞株NIH3T3由本实验室提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 siRNA的设计合成 以小鼠clock cDNA序列为模板，根据干扰质粒设计原理[18]，同时结合Mfolder生物软件对clock mRNA二级结构的分析结果，确定两个作用干扰位点，分别合成clock干扰质粒（武汉晶赛生物工程技术有限公司）。

　　1.2.2 重组干扰质粒构建与鉴定 将合成的2个目的片段和1个阴性对照片段分别经退火处理，从而得到3对siRNA序列，分别命名为RNAiclockⅠ、RNAiclockⅡ、NC。pGenesil1干扰质粒（图1）经BamHⅠ和HindⅢ双酶切、纯化，然后通过DNA连接试剂盒与3对siRNA序列连接，构建干扰质粒，分别命名为pGenesil1/clockⅠ、pGenesil1/clockⅡ、pGenesil1/NC。提取质粒DNA，并进行序列分析（上海生工）。

　　图1 pGenesil1/clock干扰质粒

　　1.2.3 细胞培养、转染 快速复苏NIH3T3细胞后加入到RPMI Medium 1640完全培养基中，于5%CO2孵箱37℃静置培养，以每孔2×105个细胞接种于六孔板，通过Lipofectamine2000阳离子脂质体介导转染干扰质粒，无血清无双抗MEM培养液洗涤细胞。随后将clock干扰质粒-Lipo复合物滴加到细胞上，每皿约为220μl，并重复加入0.8 ml无血清无双抗MEM培养基，CO2孵箱中37℃下培养6小时。在转染后48小时换含50％马血清的1640细胞培养基，2小时后换为无血清培养基进行马血清休克诱导NIH3T3细胞clock表达。以空阳离子脂质体为对照，在起始转染24 h-72 h内检测转染细胞并计算转染效率，当转染效率达到90%以上时，采用Trizol收集细胞备用。

　　1.2.4 RTPCR Trizol法提取上述3组细胞的总RNA，逆转录得到cDNA。根据小鼠clockcDNA序列及gapdh mRNA序列设计RTPCR检测引物如表1（Tab.1）。

　　表1 clock和gapdh基因RTPCR扩增引物

　　Sense primerAntisense primerclock5'CCCAACTCCTTCTGCCTCC3'5'ATCCGTGTCCGCTGCTCT3'gapdh5'GGGAAACTGTGGCGTGAT3'5'GTGGTCGTTGAGGGCAAT3'　　利用RTPCR检测试剂盒检测干扰质粒Ⅰ、Ⅱ及阴性对照组的mRNA表达并以gapdh为内参照，进行逆转录反应。反应体系中加入25μL 2×mRNA Selective PCR bufferⅠ，1μL RNase inhibitor，10μL MgCl2，5μL dNTP/analog Mixture，1μL AMV Rtase XL，1μL AMVOptimized Taq，上、下游引物各1μL，cDNA各4μL(1为干扰质粒pGenesil1/clockⅠ转染组；2为干扰质粒pGenesil1/clockⅡ转染组；3为阴性对照质粒转染组)共3组，补齐各体积到50μL。反应条件：50 ℃ 30 min;(85℃ 60s，60℃ 60s，72℃ 60s)，进行30个循环；最后72℃ 5min。待反应完成后，每管各取3μl扩增反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。拍摄扫描图像用GelPRO ANALYZER软件测定各条带积分光密度值（IOD）。

2结果

　　2.1 siRNA的设计选择2个干扰位点：

　　Ⅰ:5’GGAACATCAGGCTATGATT3’；

　　Ⅱ:5’GCTTCAGACTCATTATTAT3’；

　　同时选择1个阴性对照（NC），根据选择的干扰位点设计干扰序列如表2。表2 clock基因干扰质粒干扰序列

　　2.2 重组干扰质粒干扰效率RTPCR产物电泳结果显示产物大小和预期一致。用GelPro Analyzer软件，分析不同组RTPCR所得材料clock及gapdh条带的IOD，计算Rtime=IODclock/IODgapdh。结果（图2）显示pGenesil1/clockⅡ干扰质粒干扰效率最高，其clock表达量降低了74%，而pGenesil1/clockⅠ的干扰效率较差，其clock表达量只降低了2%。

　　图2 clock基因干扰质粒效率

　　图3 bHLHPAS区3D结构分子模型

　　3 讨论

　　在后基因组时代，基因功能的研究显然是解决疾病和公共健康问题的核心和焦点问题，科研工作者试图从基因的表达和阻遏两种相反的思路中获取更详实的信息以最终明确基因的功能和特性。在复杂的信号传导通路中往往单独的基因表达增强手段并不能很好凸显基因作用结果，而结合阻止（或消减）目的基因表达往往可以使难以判断的分子事件趋于明朗。传统阻遏基因功能的方法诸如核酶、反义核酸技术显得流程复杂，效率低下。而RNA干扰技术，从1995年康乃尔大学Su Guo博士发现RNAi这一现象以来，就表现出巨大潜力，并迅速在生命科学研究的广泛领域得到普及。

　　时间生物学这一新兴学科在现代分子生物学技术的帮助下发展迅速，不断有新的节律基因被发现，而节律基因各种新的功能也不断被探明。小鼠clock基因定位于5号染色体上，先前的研究表明该基因是节律系统的核心元件，调节着其它节律基因的变化，在保持生物体稳态中起着重要作用[1，19]。实验证实clock基因与Bmal1共同形成正向元件二聚体，通过各种信号转导通路调控下游诸如period(per)和cryptochrome(cry)等钟基因的表达[20-26]。最近的研究报道clock基因与不孕不育、肥胖及脂肪代谢异常[27]、高血压疾病、糖尿病、急性心肌梗塞（AMI）等病理过程高度相关[28]，而clock基因通过何种途径调控这些事件的发生显然是揭开诸多谜团的关键。RNA干扰技术正是通过对clock表达的负性调节来观察其下游分子活动，从而发现可能存在的信号转导通路，以更深层次的探明clock基因的功能及病变发作机理[29-31]。为此我们设计并构建了clock基因干扰质粒。根据clock基因结构特点我们选择两个干扰位点，并构建了pGenesil1/clockⅠ、pGenesil1/clockⅡ两个干扰质粒。通过观察RTPCR电泳结果条带及用GelPro Analyzer软件分析不同条带IOD值，我们发现pGenesil1/clockⅡ干扰质粒干扰效率理想，其clock表达量降低了74%左右，而pGenesil1/clockⅠ的干扰效率较差，clock表达量只降低了2%左右。两种干扰质粒干扰效率差异显著。结合clock基因的空间结构，我们发现两者存在联系。小鼠clock基因含有许多特殊的保守结构域，从而形成具有特殊功能的RNA转录产物和CLOCK蛋白，其属于转录调节因子bHLHPAS家族（basical helixloophelixPAS family），而clock基因表达产物存在bHLH、PASA、PASB等4个保守的结构域（Fig.3），与此同时clock基因自身呈现出特殊的空间构象。我们所设计的干扰位点在遵循干扰质粒构建原则的基础上依然存在一定的随机性，遇见clock基因局部结构域不能很好暴露到空间位点，导致干扰质粒的基因序列不能充分和目标位点结合，从而造成了干扰效率低下。所以基因的局部空间结构较大的影响着干扰质粒的干扰效果。显然在基因结构特点、碱基配比和偏好以及基因组同源性等诸多限制因素中我们需要找到最优的结合点[32]，所以本身具有经验性的RNA干扰序列设计、合成过程中，我们需要充分的利用NCBI、EMBL、DDBJ等核酸数据库资源并通过充分的同源性比对（BLAST）以期获得最佳干扰效率的质粒，因为在不同的物种同一基因的干扰质粒并非能取得平行的效果，同时还将注意RNA干扰对正常基因可能潜在的“毒性”[33]。本次实验我们设计的小鼠clock基因干扰质粒pGenesil1/clockⅡ能够将RNA转录产物降低74%左右，主要是干扰位点避开了clock基因的保守结构域，使得干扰序列与clock基因充分结合，从而达到了良好的干扰效果。这为实验室继续开展信号通路的研究奠定了坚实的基础。RNA干扰技术为探明节律基因的生物功能提供了一条快捷、经济的途径，相信随着此技术的不断完善，时间生物学作为现代科学领域中一门旨在提高人类社会生活质量的软科学，其价值将得到更强显现。

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