四氢生物喋呤对肾切除5/6大鼠高血压和尿蛋白的治疗作用

【摘要】 目的：探讨四氢生物喋呤（BH4）对肾切除5/6（NX）后大鼠血压和尿蛋白的影响。方法 38只大鼠按照处理方法的不同分为五组：NX组、NX + BH4组（腹腔注射）、NX + L精氨酸（LA）组、NX + 口服地尔硫卓（DILT）组 和假手术组。手术24小时后开始给药，并分别在给药前和给药后的第4周和第8周测量收缩压、测定尿蛋白和肌酐清除率。在实验的第8周末观察肾脏的组织学改变。结果：与假手术组比较，NX大鼠收缩压和尿蛋白均明显升高(P&<0.01)；BH4、LA及DILT 对NX 所产生的高血压均有降低作用(P&<0.01)；BH4、LA 和DILT 均使NX 的尿蛋白明显减少(P&<0.01)，但DILT 的减少幅度相对较小；NX 各组，血尿素和血清肌酐都升高，血浆肌酐清除率都降低，各组之间无明显差别（P&>0.05）。NX 后的大鼠出现肾小球系膜扩张，而各治疗组肾小球系膜扩张的程度较轻。结论：NX大鼠，手术24小时后补充BH4，在8周的观察期内可以使血压保持正常，并有减少尿蛋白、阻止肾小球系膜扩张的作用。

【关键词】 四氢生物喋呤；血压；一氧化氮；蛋白尿；大鼠

肾切除5/6（NX）的大鼠，产生高血压，并且出现残留肾脏的形态学异常改变，它是研究保肾和抗高血压治疗措施常用的动物模型[1]。NO合酶（NOS）催化底物L精氨酸（LA）产生NO，BH4是NO合酶（NOS）的关键因子，因此BH4与NO的生成量密切相关。BH4对原发性高血压大鼠（SHR）具有降压作用，这种降压作用与传统的降压药的区别尚未见报道。本研究的目的在于探讨BH4对NX大鼠高血压作用特点及其BH4对NX所引起的肾功能异常和肾脏形态学异常的治疗作用。

1 实验方法

　　1.1 分组及手术实验选用45只Wistar大鼠，体重380±29 g，正常饮食，自由饮水。戊巴比妥（35 mg·kg-1体重）腹腔麻醉。切除右肾，并结扎左肾动脉的两个主要分支，完成肾脏5/6切除。手术后的大鼠随机编为5组：NX组(n=9)，只作5/6肾切除；四氢生物喋呤（BH4）组（n=9），5/6肾切除后再腹腔注射BH4每日10 mg·kg-1；L精氨酸（LA）组（n=9），NX大鼠每日饮水中加入LA1g/L，每日量130 mg·kg1；地尔硫卓组(DILT)组（n=9），NX大鼠每日饮水中加入DILT 每日30 mg·kg-1；假手术（Sham）组（n=9），腹部切开后缝合，对大鼠施行假手术。分别与术前和术后的第4周、第8周，使用MRBⅢA电脑大鼠血压心率测量仪(上海市高血压研究所)测量大鼠尾动脉收缩压。实验给药均在手术24小时后开始。

　　1.2 实验室测定实验末了，测定血清白蛋白和胆固醇。实验前一天和实验后的第4和第8周末测定血清肌酐浓度。实验前和实验后的第4周和第8周收集相邻两天的尿量，用来测量血浆肌酐清除率和尿蛋白。收集尿之前的大鼠，每百克饮食中加入0.35 gNaCl、20 g蛋白质和1.17 g精氨酸。为防止细菌感染，试管中加入6 mg的庆大霉素。标准方法测定血清肌酐、白蛋白、胆固醇和蛋白尿。

　　1.3 组织学检查最后，各组动物断头处死，取肾脏组织，福尔马林固定，加入石蜡油，染色和切片后在光学显微镜下观察。每只肾脏检测40个肾单位。使用半定量的方法来评估肾小球损伤的程度。用放大100倍的光镜评估小管间质性变和血管损伤的程度。量化标准依照Adamczak等[2]的实验进行。

　　1.4 统计学处理结果使用means±SD表示，计量资料使用t检验，计数资料使用方差分析。

　　2 结果

　　2.1 血压变化实验过程中，在NX组、BH4组、LA组分别各有1只大鼠因发生了严重的肾衰而死亡，被排除在实验之外。整个实验过程中，各组大鼠饮食和饮水的摄入量无明显差别。与Sham组比较，NX组收缩压明显升高(P&<0.01)。而各药物处理组（BH4组、LA组和DILT组）血压和Sham组比较无明显差别（P&>0.05），即BH4、L精氨酸或地尔硫卓对NX均有降血压的作用。各药物处理组之间血压无明显差别，见图1。

　　2.2 实验室检查各组尿量无明显差别。NX组和Sham组比较血清肌酐水平、血尿素水平和24h尿蛋白量均增高（P&<0.01），24小时血浆肌酐清除率和血清白蛋白明显降低（P&<0.01）。NX组和各药物处理组比较血清肌酐、血尿素和24小时血浆肌酐清除率无明显差异（P&>0.05）。使用BH4、LA和DILT治疗均可以使24小时尿蛋白量降低，但DILT引起的降低幅度较前二者的幅度小。

　　图1 四氢生物喋呤对肾切除5/6大鼠收缩压的变化

　　2.3 组织学检查与NX组比较，各处理组（BH4组、LA组和DILT组）肾小球系膜扩张明显改善；NX组、DILT组大鼠均发生了小管间质性变，但BH4组和LA组小管间质性变不明显。

3 讨论

　　肾脏次全切除术后，血管内皮细胞对NO的生物利用度降低，从而造成高血压和肾衰的产生[3]。NO是由NOS催化底物LA产生，因此NOS活性的降低和LA的含量减少均可以影响NO的生成。抑制NOS活性的因素包括底物的减少（LA）、NOS功能的损伤、NOS的向下调节及NOS抑制物的累积等。有文献报道，对NX大鼠使用LA治疗可以对血压和肾功能产生有益的影响[1]。由于BH4是NOS重要的辅因子，当BH4缺乏时，NOS催化底物LA不是产生NO，而是产生过氧化物[4]。

　　NX 48h后，大鼠出现明显的高血压。补充BH4，可以阻止高血压的产生，维持给药十天，血压保持在正常范围之内。补充BH4期间NOS蛋白的表达增加。为了探讨BH4是否具有长期降压效应，本实验给予BH4后，观察期延长至第8周，并且与LA及传统的降血压药物进行比较。传统的降压药物选用非二氢吡啶钙通道阻滞剂地尔硫卓，因为与二氢吡啶类钙通道阻滞剂比较，目前尚没有资料显示地尔硫卓在体内可以影响NO的生成[5]。结果表明，在连续8周的观察期内，BH4有明显的降血压效应，且与LA和地尔硫卓的降压作用进行比较，其降压效果无明显差别。

　　BH4的降血压效应在肾功能正常的高血压大鼠模型曾有报道[6]。由于NX大鼠，不仅有高血压，还有蛋白尿等肾功能损坏的表现，因此我们研究了BH4对肾功能的影响。结果表明，使用BH4有减少尿蛋白和减轻肾小球系膜扩张的作用。LA和DILT都可以使蛋白尿的减少，但DILT的降低幅度较BH4和LA低。提示治疗高血压伴有蛋白尿的患者，使用BH4或LA可能会取得较好的治疗作用。肾小球系膜扩张是肾小球硬化的先兆，实验中我们发现使用BH4较其它药物处理组（LA组和DILT组）肾小球系膜扩张明显减轻。使用BH4后肾小管间质性变（严重肾功能病变的另一个标志）也有明显改善。实验的第8周末血清肌酐和血尿素浓度增高，而血浆清除率明显降低，说明NX术后，大鼠都不同程度的产生了尿毒症，各种药物治疗措施并没有使尿毒症得到改善。

　　慢性肾衰的大鼠为什么BH4的生物利用度会降低呢？研究表明，慢性肾衰时，过氧化物歧化酶的生成减少和NADPH氧化酶的表达增加[7]，这些均有利于生成更多的过氧化物，产生氧化应激。而增加NADPH氧化酶的表达，可以使BH4的氧化增加，血管内皮细胞内的BH4减少，NOS脱偶联，NO的合成减少，ROS的合成增多。口服BH4可以降低ROS的产量，增加NO的产量，从而使血压降低。

　　总之，BH4对NX大鼠有明显的降压作用，同时减少蛋白尿，并阻止肾小球系膜扩张。增加BH4增加NO的合成，并阻止氧化应激，可能有利于治疗慢性肾衰伴有高血压的患者。

参考文献

1 Ashab I， Peer G， Blum M， et al. Oral administration of Larginine and captopril in rats prevents chronic renal failure by nitric oxide production[J]. Kidney Int 1995， 47(10): 15151521.

2 Adamczak M， Gross ML， Krtil J， et al. Reversal of glomerulosclerosis after highdose enalapril treatment in subtotally nephrectomized rats[J]. J Am Soc Nephrol 2003， 14(23): 28332842.

3 Dumont Y， d'Amours M， Lebel M， et al. Supplementation with a low dose of Larginine reduces blood pressure and endothelin1 production in hypertensive uremic rats[J]. Nephrol Dial Transplant 2001， 16(2): 746754.

4 Gorren AC， Mayer B. Tetrahydrobiopterin in nitric oxide synthesis: a novel biological role for pteridines[J]. Curr.Drug Metab.2002， 3(1): 133157.

5 Heitzer T， Brockhoff C， Mayer B， et al. Tetrahydrobiopterin improves endotheliumdependent vasodilatation in chronic smokers: evidence for a dysfunctional nitric oxide synthase[J]. Circ Res 2000， 86(1): 3641.

6 Stroes E， Kastelein J， Cosentino F， et al. Tetrahydrobiopterin improves endothelial function in hypercholesterolemia[J]. J Clin Invest 1997， 99(1): 4146.