大鼠单根近球肾小管钠泵活性测定的改良方法

　　　　　　 作者：罗蕾 刘红 余德芊 刘爱东 高原

【摘要】 目的：以Doucet介绍的方法为基础，改良了测定大鼠肾脏近端小管Na+K+ATPase活性的方法。方法：首先，利用自制的玻璃分针能准确而迅速的分离获取近端小管；其次，使用传导性能较好和易于折叠的锡箔纸代替了铝片，简化了孵育和测定过程。结果：改良方法与Doucet建立的经典方法比较，测定结果无显著性差异(P＞0.05)；但对小管长度确定平均耗时和转移含32P的孵育液平均耗时明显降低。结论：本文介绍的测定大鼠肾脏近端小管Na+K+ATPase活性的改良方法，减少操作步骤，缩短了操作时间和暴露在放射性环境中的时间；简化并改进了操作条件，降低了实验要求和成本。

【关键词】 近球小管; 钠泵; 活性测定; 改良方法; 大鼠

肾小管基底膜上的钠泵，是肾脏实现其功能作用的关键酶，测定该酶的活性，对不同状况下肾脏的功能研究具有重要的意义。测定单根肾小管钠泵活性的方法，Doucet首先于1979年进行了较为详细的报道[1]（简称Doucet法），该方法目前仍是测定肾小管钠泵活性的最精确最常用的方法，特别是测定不同节段肾小管的钠泵活性[2]。过去的二十多年，Doucet法得到了一些改进[3，4]，但是改进并不显著。Doucet法的技术要求高，准备与操作过程都比较复杂耗时，与32P接触时间较长，而该物质放射性相对较强，国内大多数实验室都不便开展，造成此项研究工作在国内的几近空白。改良Doucet法（简称改良法），即在不影响测定结果的情况下，简化操作条件及步骤，降低物耗和时耗，使它适用于国内一般实验室，就显得十分必要和迫切。

1 材料

　　1.1 实验动物雄性Wistar大鼠，体重200g，购自南方医大学动物实验中心。

　　1.2 主要试剂及器材Hepes、Na2ATP、哇巴因和Ⅱ型胶原酶（Sigma）。[γ32P]ATP(北京福瑞特公司)。XTJ5400体视显微镜（广西梧州光学仪器厂），配套显像系统购自日本Unican公司。SN6930A型液体闪烁计数器(上海核所日环公司)。基础分离液、液闪液及钠泵活性测定液的配制参照Doucet1990年报告的方法[2]。

2实验方法

　　选取10只大鼠，平均分为2组，分别用于Doucet法和改良法测定小管的钠泵活性，改良法实验方法如下：

　　2.1 单根肾近球小管的分离实验大鼠用1%戊巴比妥钠（40mg·kg-1，ip）麻醉后，右侧位固定于鼠板上。再沿脊柱左侧剪开皮肤，暴露肾脏，分离腹主动脉，结扎除左肾动脉以外的分支，经腹主动脉插管灌注左肾，先用1ml 1%肝素钠溶液，接着用1ml 0～4℃含0.2%胶原酶的分离液灌注。灌注后迅速切下左肾，除去肾包膜和肾蒂结构，置于洁净玻片上（玻片下放置低温冰袋）。用剃须刀片，将肾皮质沿皮质髓质轴切成0.5～1.0mm厚的薄片。将大约10片肾组织放入一容积为2ml的离心管中，管内预先装有1ml含0.15%胶原酶的分离液并预热至37℃，恒温水浴槽中孵育15～20min，持续充入95%的O2和5% CO2的混合气体。孵育完毕用2ml含0.05 %牛血清白蛋白的分离液漂洗3～4次，0～4℃保存并于30min内完成分离。吸取0.1ml含肾小管组织的分离液到细菌学载玻片的中央凹处，在体视镜载物台上放置一个直径为90mm培养皿，内装洁净冰水和碎冰块，在培养皿内放置一个合适铝架，载玻片平放在铝架上，使玻片底部刚好与冰水接触（提供0～4℃的分离环境），用微分离针分离小管。辨认近球小管是根据它与肾小球、肾小囊、入球小动脉和其它肾小管节段的解剖关系和形态学特点决定的。转移前的小管直接摄像并保存图片，根据放大倍率确定小管长度。

　　2.2单根肾近球小管钠泵活性测定将0.5×0.5cm大小的锡箔纸15片紧贴在铝合金属盘内，纸片中央滴加5μl分离液，10根分离的单根小管分别转移到其中10片纸片上的分离液中，5片不含小管的作空白对照。分别用5μl蒸馏水代替小管周围等渗液，用保鲜膜密封金属盘，4℃，15min后，重新用5μl蒸馏水替换。随后，将密封金属盘直接与－80℃的超低温冰袋接触使其快速冰冻，然后将金属盘放置在0～4℃的冰箱内，待其逐渐融化后，含小管的10张锡箔纸片随机分成两组，分别滴加1μl测定总ATP酶或Mg2+ATP酶活性的孵育液。将金属盘密封后放入37℃水育箱，孵育15min后将金属盘移到碎冰上，分别加入5μl 5%冷三氯醋酸终止反应。分别将锡箔纸连同反应液转移到含有2ml 10%活性炭悬液的试管中，混匀后离心沉淀（2500rpm，10min），取上清500μl直接放入含5ml液闪液的计数瓶，将液闪瓶放入液体闪烁计数器中，静止3小时，测定各样本CPM值。采用Doucet建立的公式计算，钠泵活性用单位长度小管单位时间水解ATP释放无机磷的数量来表示（pmol·mm-1·h-1），即以酶促反应速度表示酶的活性。

3 结果

　　3.1 微分离小管的结果图片见图1，A表示转移后的单根肾近球小管节段；B表示微分离的近球小管电镜图象。电镜下可见近球小管管腔面排列有长而密集的微绒毛（箭头所示），它是近球小管独特的超微结构。其次可见侧突发达，质膜内褶较深，可达细胞的游离面，胞吞小泡多，溶酶体发达，长杆线粒体十分丰富，与质膜内褶平行排列。

　　3.2 两种方法钠泵活性测定结果与部分操作耗时比较结果见表1，运用改良法测定钠泵活性结果无显著差异，但对小管长度确定平均耗时和转移含32P的孵育液平均耗时明显降低。表1 两种方法测定结果与部分操作耗时比较注：*与Doucet法比P＜0.05

　　4讨论

　　测定肾小管钠泵的活性，Doucet法仍是目前最常用的方法。本实验技术是在Doucet法的基础上，进行了较大的改进和完善，使实验条件和实验本身变得相对简单易行，可操作性大为提高，而且对测定结果并无明显影响。

　　本实验方法的改进主要体现在以下十个方面：①固定方法：与以往仰位固定比较，右侧卧位固定，沿脊柱左侧手术，左肾动脉及腹主动脉暴露充分，手术过程快，对其它脏器的影响小。②灌注：选择从腹主动脉途径插管灌注，比直接在左肾动脉插管要安全快捷；先使用抗凝剂肝素冲洗，能够清除肾脏内血液成分，减少胶原酶的用量以及方便后面的漂洗和分离。③灌注液和灌注速度：使用高浓度低用量的灌注液，降低灌注速度（0.5ml·min-1），可以提高胶原酶的利用率，缩短孵育时间，提高孵育效果。④通气装置：本实验用一简易装置完成，即在医用氧气袋的橡皮管上连接一个三通管，在其中一个通道上接上一根聚乙烯小管，即可方便控制通气。⑤微分离针：分离针是利用玻璃毛细吸管，在酒精喷灯上拉制而成，因为这种方法制备的微分针前端带有小弯钩，比用玻璃微电极拉制器拉制的微分针更加方便实用。⑥分离环境：环境温度稍高，载玻片上小管周围液体稳态环境极易改变，严重影响小管生物活性，但是，在一般实验室，提供一个0～4℃的工作环境是比较困难或造价高昂。本实验设计了一个简易的低温操作环境，效果好，几乎无需成本。⑦小管长度的确定：将小管转移到另一载玻片上，使用倒置显微镜拍照，确定小管长度，然后再将小管转移到发生酶促反应的铝片上。这样操作难度大，小管暴露时间长，酶的活性容易受到影响。如果在体视镜上装上显像系统，就可以在小管分离后，转移前进行直接拍照。这样，既简化了操作步骤，又能最大程度保证小管及酶的活性。⑧冻融材料：以往使用的干冰，在很多地方不易购买，保存时间又短。用存放在-80℃的超低温冰袋代替干冰，成本极低，操作方便。⑨酶促反应载体：将以往的带凹固定铝槽，换成超薄锡薄纸片，紧贴在金属盘内，反应终止后，直接将锡薄纸片转移到活性碳悬液中，快速方便，避免以往反复清洗铝槽造成的无机磷丢失，提高实验结果的准确性。由于32P的放射性较强，反应载体的改变可以大幅缩短操作者与辐射物接触的时间。⑩密封金属盘：在小管钠泵活性测定的各个环节中，保证小管环境的相对密闭性，防止反应液蒸发或与水雾混合，是本实验成败的关键因素之一，使用保鲜膜密封金属盘，经济实用。

　　这种改良方法，基本原理和肾小管钠泵活性测定结果与Doucet的方法一致，但方法改良后，简化了实验条件，降低了实验成本，缩短了操作时间，能大幅度提高实验成功率。

参考文献

1 Doucet A， Katz AI， Morel F. Determination of NaKATPase activity in single segments of the mammalian nephron[J]. Am J Physiol Renal Fluid Electrolyte Physiol， 1979， 237(2):105113.

2 刘红，罗蕾，高原. 2型糖尿病大鼠近球Na+K+ATPase活性变化[J]. 第三军医大学学报.2006， 28(20): 20622064.

3 Cheval L， Doucet A. Measurement of NaKATPasemediated rubidium influx in single segments of rat nephron[J]. Am J Physiol Renal Fluid ElectrolytePhysiol， 1990， 259(1): 111121.

4 Levillain O， HusCitharel A. Ornithine decarboxylase along the mouse and rat nephron. Am J Physiol. 1998， 274(6 Pt 2): 10201028.