大鼠骨髓间充质干细胞对淋巴细胞增殖影响的体外实验

【摘要】 目的：探讨大鼠骨髓间充质干细胞对淋巴细胞增殖的影响。方法:常规分离培养大鼠的骨髓间充质干细胞(MSCs)及淋巴细胞，灭活后的骨髓间充质干细胞和淋巴细胞混合培养48h后，MTT法检测淋巴细胞的相对细胞数，Hoechst 33258染色观察细胞核变化。结果:MTT结果显示，加入MSCs组OD值明显低于未加MSCs的对照组（p＜0.05）。Hoechst 33258染色显示MSCs组淋巴细胞有核固缩及凋亡小体出现。结论:MSCs对淋巴细胞的增殖有抑制作用，其作用机制可能与细胞凋亡有关。

【关键词】 间充质干细胞；淋巴细胞；细胞增殖

骨髓间充质干细胞（MSCs）是骨髓中的具有多向分化潜能的干细胞，在造血调控、组织工程和基因治疗等方面具有广阔的临床应用前景。已有实验表明体外扩增培养的MSC可以抑制混合淋巴细胞反应，减轻移植排斥，延长移植物的生存时间等，其免疫调节功能研究已是移植治疗中的研究热点[1-3]。我们实验显示MSCs对淋巴细胞的增殖抑制作用明显，其作用机制可能与细胞凋亡有关。现将结果报道如下。

1 材料和方法

　　1.1 主要试剂及仪器

　　SD大鼠购自四川大学华西医学中心动物中心，6周龄，体重约60～80 g。DMEM、RPMI1640培养基（美国Gibco公司），淋巴细胞分离液(Pharmacia公司)，IL2(Sigma公司)，青霉素、链霉素（华北制药有限公司），小牛血清（兰州中美合资民海生物有限公司），胰蛋白酶（美国Gibco公司），超净工作台(日本NUAIR公司)，二氧化碳培养箱（日本SANYO公司），倒置相差显微镜（日本Olympus公司），全自动酶标仪（德国BIORAD，Model 550)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 大鼠MSCs的分离和培养采用全骨髓培养法分离培养MSCs。48 h后弃悬浮细胞，继续培养已贴壁细胞。细胞生长至80～90％融合后，改用10%小牛血清的DMEM低糖培养基传代培养。

　　1.2.2 大鼠脾脏淋巴细胞的制备无菌取出大鼠脾脏，研磨过尼龙网，分散的淋巴细胞透过尼龙网后应用淋巴细胞分离液获得淋巴细胞。洗涤2次后重悬于10%小牛血清的RPIM1640培养基中。在37℃饱和湿度的CO2孵箱中孵育2-4 h后，收集未贴壁悬浮细胞。

　　1.2.3MTT法淋巴细胞混合反应实验 取第三代对数生长期MSCs经30Gy60Co照射后按1×104个/孔，淋巴细胞按5×104个/孔的种入96孔板中，各孔均加入刺激剂IL2（1000 U·mL-1）。37℃饱和湿度CO2孵箱中孵育48 h，MTT法检测淋巴细胞相对细胞数。

　　1.2.4 Hoechst 33258染色经30Gy60Co照射后的MSCs与淋巴细胞按1:5比例接种于含10%胎牛血清的RPIM1640培养基的25 cm2培养瓶中，并加入刺激剂为IL2（1000 U·mL-1）。CO2孵箱中培养48 h后采用50 μg·mL-1 Hoechst 33258染色10 min，PBS洗涤2次后涂片，荧光显微镜下观察细胞核。

2 结果

　　2.1 MSC的分离、培养及鉴定 MSC通常在培养2天左右，可以出现单个分散存在或形成只有几个细胞的克隆，细胞形态呈长梭形。贴壁的MSC增殖迅速，培养10天左右每个克隆包含100-200个细胞，12-15天时细胞呈现80-90%融合(图1)。体外分化实验显示其能分化为成骨、成软骨及神经等多种细胞。

　　图1 原代培养第3代大鼠骨髓间充质干细胞

　　2.2 MSCs抑制淋巴细胞增殖作用结果 MTT结果显示加入MSCs的实验组淋巴细胞数比未加MSCs的对照组明显减少，并具有统计学意义（p＜0.01），见表1。表1 MSCs抑制淋巴细胞增殖作用结果*注：*与对照组相比，p＜0.012.3Hoechst 33258染色结果经IL2刺激培养48 h后，与MSCs共同培养的淋巴细胞有分裂的细胞核碎片出现，而未加MSCs的淋巴细胞细胞核完整，没有核固缩和核脆裂现象。MSCs的实验组淋巴细胞凋亡率明显升高（p＜0.01），见表1。

3 讨论

　　对MSC功能研究发现，其除可以作为组织工程研究的种子细胞外，还具有支持体外造血，促进体内造血重建的功能。最近研究发现MSC具有免疫负调节作用，如诱导免疫耐受，抑制排斥反应，提高器官移植的成功率并能减轻自身免疫疾病的病情等[2-5]。

　　本实验证实MSCs可在体外显著抑制由IL2引起的淋巴细胞增殖，同Bartholomew等[3，4]报道一致。已有研究表明MSCs不仅引起了淋巴细胞的增殖停滞，还可能诱导了淋巴细胞的凋亡或死亡。如Plumas[6]等发现MSCs可以引起活化淋巴细胞凋亡的发生，其原因可能与吲哚胺2，3－二氧化酶的作用有关。我们也发现与MSCs共同培养48 h后的淋巴细胞出现核固缩及分裂的细胞核小块，推测MSCs可能诱导了淋巴细胞的凋亡，但其作用机制尚待进一步研究。

　　总之，MSCs对淋巴细胞的增殖抑制作用确切，有望在移植治疗中得到拓展及应用。

参考文献

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3 Bartholomew A， Sturgeon C， Siatskas M，et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo [J]. Exp Hematol， 2002， 30(1): 42-48.

4 Nicola MD， CarloStella C， Magni M， et al. Human bone marrow stromal cells suppress Tlymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli [J]. Blood， 2002， 99(10): 3838-3843.

5 Krampera M， Glennie S， Dyson J， et al. Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigenspecific T cells to their cognate peptide [J]. Blood， 2003， 101(15): 3722-3729.

6 Plumas J， Chaperot L， Richard MJ， et al. Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells[J]. Leukemia， 2005， 19 (9):1597-1604.