中药风湿宁对佐剂性关节炎大鼠关节滑膜组织ICAM1表达的影响

　　　　 作者：黄映红 曾洁萍 张耿豪

【摘要】 目的：探讨中药复方风湿宁(FSN)对实验性类风湿性关节炎(RA)的疗效及作用机理。方法：以佐剂性关节炎(adjunvant arthritis，AA)大鼠为实验对象，分别予以FSN与雷公藤多甙(TWP)进行治疗，对照观察大鼠关节肿胀程度，以及关节内病理组织学变化情况。采用免疫组织化学检测各组AA大鼠病变关节滑膜组织中ICAM1的表达。结果：FSN可显著抑制AA大鼠足跖肿胀，明显减轻病变关节滑膜炎症与增生，防止关节软骨及骨质的破坏;FSN能明显降低ICAM1在AA大鼠滑膜组织的表达(P&<0.01) 结论：FSN具有改善实验性RA症状及病情的作用，其抗炎作用与调控滑膜细胞细胞间及细胞细胞外基质间的粘附作用有关。

【关键词】 风湿宁;佐剂性关节炎;细胞间粘附分子1(ICAM1)

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis ，RA) 是一种常见的以关节滑膜病变为主的自身免疫性疾病[1]。由于RA病理表现复杂，发病机制也尚未明确，临床治疗相当棘手。众多研究均显示，中药抗RA具有一定的优势，抗RA中药除抗炎镇痛作用外，还具有免疫调节效应，表现出整体调节、多环节、多途径的作用[2]。本研究以完全弗氏佐剂诱导的佐剂关节炎(Adjuvant arthritis， AA)大鼠作为RA动物模型，观察王再谟教授临床经验方——风湿宁(FSN)治疗RA的作用特点，并且通过检测大鼠关节滑膜组织内ICAM1的表达，探讨FSN抗炎作用的机制，为该方的临床应用以及中药抗RA作用机理的研究提供新的理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物 雄性SpragueDawlay(SD)大鼠58只，体重172～215g，由成都中医药大学动物实验中心提供(生产合格证：川实动管质第99-11号)。在清洁级实验动物室内饲养，适应性饲养2周后， 用于实验。

　　1.1.2 药品及试剂卡介苗冻干粉(60mg/支)，购自四川生物制品研究所;FSN浸膏，药物组成包括独活、威灵仙、五加皮、川芎、防己、青风藤等，由广汉市中医药研究所将原方药物制成半浸膏，临用时以蒸馏水配制成悬浊液，高、低剂量组浓度分别为0.210 g·ml-1、0.105 g·ml-1，相当于原生药1.90 g·ml-1、0.95 g·ml-1;阳性对照药雷公藤，上海医科大学红旗制药厂生产，批号20000901;羊ICAM1多克隆抗体(C19、M19)，由Santa Cruz公司提供。二抗试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物分组 将58只SD大鼠随机分为5组：正常对照组10只、模型组12只、阳性对照药组12只、FSN低剂量组12只、FSN高剂量组12只。

　　1.2.2 AA模型制作 除正常对照组外，其余各组大鼠于右后足跖皮下注射弗氏完全佐剂0.1ml致炎，诱发AA发生。

　　1.2.3 给药及标本采集实验第14d，选择已出现继发性关节炎的大鼠，开始定时灌胃治疗。正常对照组、阳性对照组致炎后给予蒸馏水灌胃;高低剂量治疗组于致炎后开始给予FSN治疗， 给药剂量分别为高剂量治疗组2.10 g·kg-1，低剂量治疗组1.05 g·kg-1，阳性对照组予TWH 10 mg·kg-1， 每日1次。末次给药后24h称重，断头处死大鼠，取大鼠左踝关节组织，灌注固定，立即送成都中医药大学附属医院病理科备检。

　　1.3指标测定

　　1.3.1 关节肿胀程度 自造模第14d始，参照文献方法[3]，对大鼠多发性关节炎进行评分，累计关节炎指数(AI)。记分标准为：0分：正常;1分：发红或微肿胀;2分：中度肿胀;3分，严重肿胀;4分：严重肿胀且不能负重。

　　1.3.2 关节HE染色观察 固定大鼠左踝关节48h，EDTA脱钙，常规进行石蜡包埋，切片4μm， HE染色，光镜下观察组织形态变化。采用BioMias计算机图象分析系统测量滑膜组织的增生程度，以每只动物三张切片所得数据的平均值代表该样本的结果。

　　1.3.3 AA大鼠关节滑膜组织中ICAM1表达 采用免疫组织化学染色法，按照试剂盒所附说明书进行检测。用BioMias计算机图象处理分析软件对信号强度进行分析，计算定量的阳性染色目标总数、积分光密度值，取每只动物三张切片所得数据的总和或平均值进行统计。

　　1.4 统计方法

　　采用SPSS统计软件进行分析。多组间比较用单因素方差分析，多组间两两比较用q检验(SNK法)。

　　2 结果

　　2.1 FSN对AA大鼠继发性关节炎变化的影响

　　从实验第9d起，观察到少数大鼠(4/48)开始出现继发性的足跖红肿;至实验第14d，大部分(38/48)的造模大鼠均发生不同程度的继发性关节炎，其中模型对照组、阳性对照组两组均为9只，FSN高低剂量组两组为10只。此外，多数大鼠的耳和尾部出现红斑、肿胀等症状，部分大鼠出现变应性角膜翳等关节外表现(见表1)。

　　2.2 左踝关节HE染色病理改变

　　模型组大鼠关节滑膜衬里层细胞增厚，滑膜组织呈绒毛状或指状肥大，并伸入到关节腔内，滑膜内可见大量炎性细胞浸润，滑膜血管增多，血管壁及其周围炎性细胞浸润明显;关节软骨表面剥脱、缺损，血管翳组织侵蚀破坏相邻的关节软骨、软骨下骨和周围肌腱;关节腔内可见退化、脱落的滑膜组织碎片，以及游离的炎性细胞。而FSN高低剂量组大鼠滑膜细胞增生、炎性浸润，及软骨和骨破坏等均显著减轻(见表2)。表1 FSN对各组大鼠不同时间关节炎指数(AI)的影响表2 FSN对各组大鼠滑膜组织细胞增生的作用(x±s)注：与正常对照组比较☆P﹤0.05， ★P﹤0.01; 与模型组比较▲P﹤0.01;2.3 FSN对AA大鼠关节滑膜ICAM1表达的影响

　　FSN组大鼠关节滑膜ICAM1表达的目标总数及积分光密度值均低于模型模型组，有极显著性差异(P&<0.01)，说明FSN组关节滑膜ICAM1的分布及表达的量均较模型对照组少。阳性对照组与FSN高剂量组类似，二者之间无显着性差异(见表3)。表3 FSN对AA大鼠关节滑膜ICAM1表达的影响(

　　3 讨论

　　关于RA的具体发病机制目前尚不十分清楚，但对其病理过程的认识已较为确切。RA的主要病理特征是持续性的滑膜炎症与增殖，血管翳形成，最终累及软骨和骨质，导致关节结构破坏、关节畸型和功能障碍。针对RA的病理时相特征，选择能有效抑制滑膜炎症、阻止骨质侵袭的药物，是RA临床治疗的重要手段。中药复方FSN具有袪风除湿，散寒镯痹，通络止痛，行气活血功效，临床治疗RA已收到满意效果。本实验进一步证实， FSN高低剂量组大鼠致炎对侧足的肿胀度明显低于模型对照组，病理组织学结果也显示病变关节滑膜组织中炎细胞浸润以及血管炎表现有一定程度的改善，提示该方对继发性病变有显著疗效，具有抑制滑膜炎症的作用。其次，与模型组对照，FSN高低剂量组大鼠滑膜细胞的增生程度也明显降低，说明该方还能抑制滑膜增生，并通过对滑膜增生性炎症的控制，有效发挥防止AA大鼠关节软骨与骨质破坏的作用。

　　在RA发病机制中，炎细胞进入滑膜以及滑膜细胞的移行增生是一个关键性过程[4]。介导细胞与细胞或细胞与基质间的粘附，以及调控细胞迁移、增生的一类膜表面糖蛋白称为细胞粘附分子。近年来的研究表明，细胞粘附分子在RA炎症反应增强和关节破坏过程中起重要作用[5]。免疫球蛋白超家族中的ICAM1为一种单跨膜的糖蛋白，可介导滑膜细胞与炎细胞以及滑膜细胞与细胞外基质之间的粘附，并参与RA病变过程中炎细胞在滑膜炎症部位的补充和聚集[6]，从而导致滑膜炎症的持续增强及滑膜增生。由于ICAM1与RA滑膜炎症形成及滑膜增生密切相关，故药物则可能通过降低其表达，抑制滑膜内炎细胞浸润以及调节滑膜细胞炎细胞间或滑膜细胞细胞外基质的粘附作用来达到抗炎和抗增生的目的。本研究表明，FSN能降低病变滑膜组织内ICAM1的表达，使单核细胞，巨噬细胞等炎性细胞与滑膜细胞的粘附受到抑制，从而减少滑膜内炎细胞浸润，控制AA大鼠关节的慢性炎症反应，阻断病情的进展。

参考文献

　1 Gary SF. Evolving concepts of rheumatoid arthritis[J]. Nature， 2003， 423 (6937): 356-361.

　　2 吕爱平主编. 类风湿性关节炎西医结合">中西医结合应用基础研究[M]. 北京: 中医古籍出版社， 第1版， 1999， 1-245.

　　3 Larsson P，Kleinau S，Holmdahl R，et al. Homologous type Ⅱcollogeninduced arthritis in rats characterization of the disease and demonstration of clinical distinct forms of arthritis in two strains of rats after immunization with the same collagen preparation[J]. Arthritis Rheum， 1990， 33(5): 693-701.

　　4 Sfikakis PP，Tsokos GC. Lymphocyte adhension molecules in autoimmune rheumatic: basic issue and clinical expectations[J]. Clin Exp Rheumatol， 1995， 13: 763-777.

　　5 Letter AJ，Buckley CD，Wordsworth P，et al. Adistinct profile of six soludle adhesion molecules(ICAM1，ICAM3，VCAM1，Eselectin and Pselectin) in rheumatoid arthritis[J]. Br J Rheumato1， 1997， 36(2): 164-169.

　　6 Szekanecz Z，Haines GK，Lin TR，et al. Differential distribution of intercellular adhension molecules(ICAM1，ICAM2 and ICAM3) and the MS1 antigen in normal and diseased human synovium their possible pathogenetic and clinical significance in rheumatoid arthritis[J]. Arthritis Rheum， 1994， 37(2): 221-231.