作者：韩旭，李七一，夏卫军，赖仁胜，陈小虎，郭宏敏，赵惠，刘福明，朱波
【摘要】 目的 通过通心络胶囊(以下简称“通心络”)对载脂蛋白E基因敲除小鼠[ApoE(-/-)]冠状动脉斑块和心肌病理组织学及其循环内皮细胞(CEC)、内皮素(ET)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、基质金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP1)等指标的干预变化，探究其治疗冠心病(CHD)动脉粥样硬化(AS)的疗效机制。方法 将40只ApoE(-/-)小鼠作为实验组，建立冠状AS模型，随机分为模型组、辛伐他汀组和通心络高、中、低剂量组，分别给予相应药物干预8周;另选8只同系的小鼠作为正常对照组。观察各组小鼠冠状动脉斑块和心肌病理组织学及其CEC、ET、MMP-1、MMP-9、TIMP1等指标的变化。结果 模型组小鼠冠状动脉病变主要位于心肌内的小分支、心肌细胞、心肌间质，均分为6.33±1.48。辛伐他汀组均分为2.62±2.25;通心络低、中、高剂量组均分为4.5±1.71、3.12±1.81、2.38±2.34。各给药组与模型组比较，P&<0.05或P&<0.01;通心络中、高剂量组与辛伐他汀组比较，P&>0.05。模型组第4周开始，血中CEC显著增多，与正常组相比，P&<0.01，与通心络高剂量组在造模后第4、8、12周相比，P&<0.05或P&<0.01，与中剂量组在造模后第4、12周相比，P&<0.05。模型组小鼠血清ET含量高于正常组，P&<0.05，与通心络3个剂量组相比，P&<0.01。通心络高剂量组MMP-1和MMP-9水平均低于模型组，而TIMP1水平高于模型组，P&<0.05或P&<0.01，通心络中剂量组MMP-9水平低于模型组，P&<0.05。结论 通心络具有抗冠状AS和稳定斑块的作用，其机制可能与改善血管内皮细胞功能障碍(EDF)和抑制血管重构相关。
【关键词】 通心络胶囊;载脂蛋白E基因敲除小鼠;冠状动脉粥样硬化;病理组织学;循环内皮细胞;内皮素;基质金属蛋白酶;基质金属蛋白酶组织抑制剂
Abstract：Objective To explore the therapeutic mechanism of Tongxinluo capsule in treating atherosclerosis (AS) of coronary heart disease by measuring the changes of coronary plaques， myocardial histopathology and circulating endothelial cell (CEC)， endothelin (ET)， matrix metalloproteinase-1 (MMP-1)， matrix metalloproteinase-9 (MMP-9)， tissue inhibitors of matrix metalloproteinase1 (TIMP1) of Apolipoprotein E gene knockout mice [ApoE(-/-)] intervened by Tongxinluo capsule. Methods Forty Apolipoprotein E gene knockout mice [ApoE(-/-)] were taken as the experimental group to establish the models of coronary atherosclerosis， and randomly pided into 5 groups (model group， Simvastatin group and high， middle， low dose of Tongxinluo group). The treatment groups were intervened for 8 weeks by Tongxinluo capsule of their respective doses and Simvastain capsules correspondingly， with other 8 isogeneic mice as the normal control group. The changes of coronary plaques， myocardial histopathology and CEC， ET， MMP-1， MMP-9， TIMP1 in each group were observed. Results The lesion of coronary in mice of the model group were mostly located at small branches in cardiac muscle， cardiac muscle， cell， myocardial interstitium， and the average score was 6.33±1.48， which of Simvastatin group was 2.62±2.25， and the low， middle， high doses of Tongxinluo capsule was 4.5±1.71， 3.12±1.81， 2.38±2.34 respectively. Compared with the model group， all treatment groups had significant difference (P&<0.05 or P&<0.01). There were no statistically significant differences between Simvastatin group and high and middle dose of Tongxinluo group (P&>0.05). Blood CEC of the model group increased considerably compared with the normal group (P&<0.01) from the fourth week， the high dose of Tongxinluo capsule (P&<0.05 or P&<0.01) at the fourth， eighth， twelfth week and the middle dose of Tongxinluo capsule (P&<0.05) at the fourth， twelfth week. Blood ET of model group was higher compared with the normal group (P&<0.05) and three Tongxinluo groups (P&<0.01). MMP-1 and MMP-9 of the model group was lower than high dose group but TIMP1 was higher. MMP-9 of middle dose group was lower than the model group. Conclusion Tongxinluo capsule can resist AS and stable the plaques， the mechanism is in connection with modifying endothetial dysfunction (EDF) and restraining vasoconstriction.
Key words：Tongxinluo capsule;Apolipoprotein E gene knockout mice;coronary
atherosclerosis;histopathology;CEC;ET;MMP;TIMP1
通心络胶囊(以下简称“通心络”)是治疗冠心病(CHD)临床疗效显著的中成药[1]，但其作用机制仍在探究。本实验通过观察其对载脂蛋白E基因敲除[ApoE(-/-)]小鼠冠状动脉斑块和心肌病理组织学及其循环内皮细胞(CEC)、内皮素(ET)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、基质金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP1)等指标的干预并研究其治疗CHD动脉粥样硬化(AS)的疗效机制。现将结果报道如下。
1 实验材料
1.1 药物及试剂
通心络胶囊，石家庄以岭药业股份有限公司生产，批号20060501;辛伐他汀片，杭州默沙东制药有限公司，批号200653。ET试剂盒由北京东亚免疫技术研究所提供，批号2006058;CEC试剂盒，由南京聚力生物制品工程公司提供，批号200601;MMP-1、MMP-9、TIMP1测定试剂盒，购自晶美生物工程有限公司，美国Oriono Diagostica公司生产，批号00604;胆固醇，上海生化试剂厂，批号051124;甲醛，南京化学试剂厂，批号20040201。
1.2 动物
ApoE(-/-)小鼠40只，8周龄，雌雄各半，体重18～22 g，北京大学实验动物中心提供(品系C57BL/6J，购自美国Jackson实验室)。同遗传背景C57BL/6J小鼠8只，8周龄，雌雄各半，体重18～22 g，许可证号：SCXK(京)2002-0001，南京中医药大学实验中心提供。实验动物使用许可证：SYXK(苏)2002-0123。小鼠单笼饲养，自由饮水，室温20～25 ℃。
1.3 仪器
Olympus荧光多功能显微镜BX60(日本Olympus公司)， Leica全自动组织处理仪TP1020(德国Leica公司)，Leica石蜡切片机RM2145(德国Leica公司)，SYSMAX全自动生化分析仪(日本SYSMEX公司)，TGL?16 g台式高速离心机(上海医用分析仪器厂)，UN-754分光光度计(上海第三分析仪器厂)， JA2003分析天平(上海天平仪器厂)，AUP-2-35 g-01实验室级专用超纯化水机(重庆颐洋实业有限公司)，DKZ-2型电热恒温振荡水槽(上海精宏实验设备有限公司)，LDZ5-2低速自动平衡离心机(北京医用离心机厂)，LRB-12752计数器(芬兰)。
2 实验方法
2.1 高脂饲料配制方法
以5%胆固醇、10%猪油加入小鼠标准饲料粉中。饲料粉经充分混合后由江苏省青龙山动物养殖场加工成颗粒饲料，高温高压消毒后真空包装待用。
2.2 造模
ApoE(-/-)小鼠适应性喂养1周后给予高脂饲料，连续喂养12周。同时选取相同遗传背景的8周龄正常C57BL/6J小鼠8只，雌雄各半，作为正常对照组。
2.3 给药
造模小鼠随机分成5组，每组8只，各组均喂高脂饲料，并连续灌胃干预8周，干预物剂量15 mL/kg。模型组：给予等量蒸馏水(各治疗组同此)。通心络低剂量组：给予通心络1 g/kg。通心络中剂量组：给予通心络2 g/kg。通心络高剂量组：给予通心络3 g/kg。辛伐他汀组：给予辛伐他汀50 mg/kg。另正常对照组喂小鼠标准饲料，同时给予等量蒸馏水。
2.4 病理组织学检查及评价方法
各组小鼠干预8周后，常规处死，取心脏置入10%福尔马林中固定，常规取材，脱水，石腊包埋，切片厚4 μm。切片经HE染色，光学显微镜观察有无冠状AS病变(包括心肌细胞、心肌间质、冠状动脉心内分支等)，并根据每种病变程度由轻到重标记为+、++、+++、++++，无病变者为“-”，并分别评分为1、2、3、4、0分。累加所有分数，并计算出每组动物的均分(±s)，分值越高提示病变程度越严重。
2.5 循环内皮细胞、内皮素检测
按文献[2]方法进行。
2.6 血清基质金属蛋白酶-1、9及基质金属蛋白酶组织抑制剂1浓度水平测定
采用定量夹心酶免疫分析技术。
3 统计学方法
描述性统计分析，定性指标以频数表示，百分率或构成比描述;定量指标以±s描述。2组对比分析，定性资料采用卡方检验，Fisher精确概率法，Wilcoxon秩和检验，CMH X2检验。定量资料符合正态分布用t检验(组间进行方差齐性检验，以0.05作为检验水准，方差不齐时选用Satterthwaite方法进行校正的t检验)，不符合正态分布用Wilcoxon秩和检验、 Wilcoxon符号秩和检验。假设检验统一使用双侧检验，给出检验统计量及其对应的P值。以P≤0.05表示有统计学意义，以P≤0.01表示有高度统计学意义。以上统计分析均用SAS统计软件进行处理。
4 结果
4.1 通心络对ApoE(-/-)小鼠动脉粥样硬化性病变的影响(见表1)表1 各组小鼠动脉粥样硬化性病变比较
4.2 病理学改变
模型组所有ApoE(-/-)小鼠冠状动脉病变主要位于心肌内的小分支，动脉主干及大分支未见明显病变。灶性心肌细胞胞浆嗜酸性增强、红染，或脂肪变性。部分区域心肌细胞横纹结构不清，轮廓不规整，间质疏松，细胞数增多。部分区域可见泡沫细胞散布于心肌细胞之间。
4.3 通心络对ApoE(-/-)小鼠血循环内皮细胞的影响(见表2) 4.4 通心络对ApoE(-/-)小鼠血清基质金属蛋白酶-1、9及基质金属蛋白酶组织抑制剂1水平的影响(见表3)
4.5 通心络对ApoE(-/-)小鼠血清内皮素的影响(见表4)表2 各组小鼠不同时点血CEC变化比较表3 各组小鼠血清MMP-1、MMP-9及TIMP1水平比较表4 各组小鼠血清ET含量比较
5 讨论
5.1 通心络对ApoE(-/-)小鼠冠状冠状动脉粥样硬化的影响
ApoE(-/-)基因缺陷小鼠是由美国洛克菲勒大学生化遗传与代谢实验室和北卡罗莱那大学病理遗传实验室应用基因同源重组的靶基因技术于1992年培育成功的[3-4]，是目前研究AS斑块较为理想的动物模型[5]。本实验显示，8周龄ApoE(-/-)小鼠在高脂饮食喂养12周后，即出现冠状AS，表示造模成功，这与国内李氏等[2]、胡氏等[6]所作ApoE(-/-)小鼠的实验模型情况亦大致相似。
表1显示，经通心络干预后，其病变较模型组均有改善，提示各剂量组对冠状AS的形成均有一定的抑制作用;结合其均分分析，通心络在改善冠状AS方面作用强弱度依次为高、中、低剂量组，其中中、高剂量组与辛伐他汀组作用相当，提示剂量大小是影响该药抗AS因素之一。其机制可能为该药具有抑制ApoE(-/-)小鼠冠状动脉管壁脂质变性与管周脂质沉积，减少了心肌细胞变性坏死及炎细胞浸润，减轻心肌间质水肿、灶性泡沫细胞沉积，从而抑制冠状AS形成的作用。
5.2 通心络干预ApoE(-/-)小鼠循环内皮细胞、内皮素的机理
血管内皮细胞(VEC)是人体最大的内分泌和旁分泌器官，通过产生和释放各种活性物质调节血管的功能，对血栓形成、血管张力调节和免疫反应等具有重要的生物学意义。VEC损伤即内皮细胞功能障碍(EDF)是AS发生发展的关键环节，许多CHD心脏事件的发生与EDF密切相关[7-8]。ET是由损伤的VEC释放，又反馈地损伤血管和心肌组织，是病变程度的一种标记物[9-10]。CEC是VEC新陈代谢的结果，其数目增多是活体EDF的重要标志，且与病情严重程度相平行。本实验提示：通心络能降低ApoE(-/-)小鼠血清CEC、ET水平，表明其具有改善EDF作用，此结果与临床研究一致[11-12]。
5.3 通心络干预ApoE(-/-)小鼠基质金属蛋白酶-1、9及基质金属蛋白酶组织抑制剂1的机理
AS的形成涉及脂质代谢紊乱、血管平滑肌细胞(VSMC)的迁移和增殖等。研究表明，细胞外基质(ECM)合成或降解失衡是AS形成过程中十分重要的环节，AS形成过程也是ECM重建即血管重构的过程[13]。MMPs是一族可降解ECM胶原的重要蛋白酶类，在AS发生期可促进VSMC向内皮的移位，其在分解冠脉粥样斑块纤维帽ECM，使纤维帽变薄、易于破裂方面起着重要作用[14]。
MMP-1、MMP-9是MMPs家族重要的一员，前者表达及活性增强与CHD的发生、发展密切相关[15]。Nikkari等[16]报道，人类AS斑块脂质核心强烈表达MMP-1，通过降解Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白，使纤维帽变薄，促进粥样斑块进入不稳定状态。后者与AS关系密切，可以高效降解基底膜的主要成分Ⅳ型胶原[17]。Peterson等[18]研究发现MMP-9的过表达，可使ECM降解活性增强，从而降低斑块强度，促使斑块破裂。TIMP1为MMPs的组织抑制剂[19]，有研究认为，正常VEC和VSMC有TIMP1和MMP-9的表达，且两者处于平衡状态，以共同维持ECM合成与降解相对平衡，使斑块趋向稳定，不易破裂[20-22]。MMP-9升高、TIMP1的降低预示着硬化斑块的不稳定或破裂。本实验结果表明，通心络通过抑制MMP-1、MMP-9和升高TIMP1而具有抑制血管重构和稳定斑块作用，且其强度与药量的大小相关。
综上所述，通心络具有抗冠状AS和稳定斑块的作用，其机制可能与通过降低CEC、ET从而改善EDF，降低MMP-1、MMP-9，升高TIMP1，从而抑制血管重构。本研究动物样本量偏少，有待今后扩大样本量进一步深入研究。
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