【摘要】 目的 建立测定大鼠组织中异钩藤碱的方法。方法 应用甲醇沉淀蛋白，然后氮吹仪吹干甲醇复溶后用反相HPLC法直接测定。以Waters·RP18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)为固定相，前置保护柱为Wondasil C18(4.0 mm×10 mm，5 μm)，甲醇-水(70∶30)含0.03%的三乙胺为流动相，流速为0.8 mL/min，检测波长为254 nm。卡马西平做内标。结果 异钩藤碱在大鼠组织中的含量标准曲线方程为：Y＝48.558X＋0.207 6(n＝6)，r＝0.999 6，在0.16～16.0 μg/mL范围内线性关系良好，平均加样回收率为99.66%，RSD＝1.56%。结论 该方法灵敏、快速、简便，专一性和重复性好。
【关键词】 异钩藤碱；大鼠组织；含量测定；高效液相色谱法
Abstract：Objective To establish a pretreatment mthod of the tissue sample of rat and a determination method of the concentration of isorhynchophylline in tissue of rats by RP-HPLC. Method The tissue sample were treated by adding methanol， and the supernatant was dried by nitrogen gas， the residue was redissolved in methanol， then detected by RP-HPLC directly. Waters· RP18 (4.6 mm×250 mm， 5 μm) and pre-column Wondasil C18 (4.0 mm×10 mm， 5 μm) were used as the stationary phase. Methanol-water (70∶30) added 0.03% triethylamine was taken as mobile phase with flow rate of 0.8 mL/min. The wavelength of detection was 254 nm. Results The standard curve of Isorhynchophylline concentraton in rat tissues：Y＝48.558X＋0.207 6 (n＝6)， r＝0.999 6， it appears a good linear relationship within the range of 0.16～16.0 μg/mL. The average recovery of was 99.66%， RSD was 1.56%. Conclusion This mehod is sensitive， rapid， simple， specific and reproducible.
Key words：Isorhynchophylline；tissue of rats；content determination；HPLC
异钩藤碱(Isorhynchophylline，Isorhy)系中药钩藤的主要生物碱之一，具有降低血压及明显负性变时等效应，与扩血管药配伍使用时，可增强降压作用，同时可克服扩血管药加快心率的不良反应[1-2]。本试验采用反相HPLC法测定大鼠组织中异钩藤碱的含量，为后期研究异钩藤碱在大鼠组织内的分布，继而对钩藤的归经理论研究奠定基础。
1 仪器与试药
日本岛津LC-20A高效液相色谱仪，包括LC-20AD 高压泵工作站，SPD-20A紫外检测器，浙江大学N2000色谱数据处理机，恒温箱。异钩藤碱对照品购于南昌贝塔生物科技有限公司，批号10525-080117，纯度98%以上。钩藤购于成都市新荷花饮片公司，经西南交通大学生命科学与工程学院药学系宋良科教授鉴定为2005年版《中华人民共和国药典》(一部)规定入药的钩藤。内标物卡马西平购自中国药品生物制品检定所，批号100141- 199503。甲醇为色谱纯，三乙胺等其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为Waters·RP18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，前置保护柱为Wondasil C18(4.0 mm×10 mm，5 μm)。流动相：甲醇-水(70∶30)含0.03%的三乙胺，流速：0.8 mL/min，检测波长：λ＝254 nm。
2.2 对照品和内标储备溶液的配制
精密称取异钩藤碱2.0 mg、内标卡马西平2.5 mg，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度线，得到浓度为200 μg/mL的异钩藤碱对照品储备液和浓度为250 μg/mL的卡马西平内标储备液。
2.3 样品制备
Wistar大鼠6只(体重在200～250 g)，灌服钩藤煎液(含原药材0.1 g/mL)，剂量为含原药材1.25 g/kg，连续灌胃3 d，第3日灌胃2 h后断头处死，取其肝、肾组织，生理盐水洗净，3层滤纸吸干，称取一定量用生理盐水制成W∶V＝1∶5的组织匀浆液。精密吸取组织匀浆0.5 mL，置于2 mL的干燥离心管中，加入100 μL的内标储备液，加2 mL甲醇，涡旋混匀30 s，静置沉淀2 h，取出，3 500 r/min离心7 min，取上清液于干燥的离心管中，氮气流吹干，甲醇500 μL复溶2 h，10 000 r/min离心5 min，取上清液20 μL进样检测。
2.4 专属性试验
按照“2.3”项下方法制备空白组织溶液、含异钩藤碱的供试品溶液。分别精密吸取空白组织溶液、含异钩藤碱的供试品溶液、对照品溶液20 μL进样并测定，色谱图见图1。结果表明，阴性样品色谱图中对照品峰相应保留时间处未见色谱峰。
2.5 线性关系考察
于空白组织匀浆中加入不同量的异钩藤碱对照品储备液(200 μg/mL的甲醇液)，配成系列浓度0.16、0.8、1.6、4.0、8.0、16 μg/mL，按照“2.3”项下方法进行处理后，分别取20 μL进样测定。以组分与内标的信号比对组分浓度做标准曲线，求得回归方程为：Y＝48.558X＋0.207 6(n＝6)，r＝0.999 6(X为异钩藤碱峰面积与内标峰面积之比，Y为异钩藤碱浓度)，在0.16～16.0 μg/mL范围内线性关系良好。
2.6 大鼠组织中异钩藤碱含量的测定(见表1、表2)
表1 肝组织中异钩藤碱的含量，表2 肾组织中异钩藤碱的含量（略）
2.7 精密度试验(见表3)
准确配制浓度为0.16、1.6、16 μg/mL异钩藤碱组织匀浆液各3管，1日内经上述组织样品处理方法处理后进行测定，计算日内精密度。不同日内测定，求得日间精密度。表3 精密度试验结果(略)
2.8 加样回收率试验(见表4)
取已测异钩藤碱含量的组织样品9份，分3组，每份0.5 mL，分别加入异钩藤碱对照品储备液(浓度为200 μg/mL)1、5、25 μL，然后按照“2.3”项下方法进行处理后，分别取20 μL进样测定。表4 加样回收率试验结果(略)
3 讨论
在已有的相关文献报道中，对异钩藤碱的体外和体内检测方法的流动相主要是甲醇-水(95∶5)[3]、甲醇-水(75∶25)[4]、甲醇-水(55∶45)[5]，含0.01 mol/L三乙胺，冰醋酸调pH 7.5。本试验根据需要采用内标法测定，故而在文献资料所涉及流动相的基础上，从95∶5到55∶45进行了筛选，最终确定了甲醇-水(70∶30)含0.03%的三乙胺为流动相。
本试验采用先用沉淀剂沉淀组织蛋白，然后氮气流吹干，再用复溶溶剂复溶。曾用乙腈、乙醇、甲醇、丙酮、氯仿、10%三氯醋酸作为沉淀剂，最后选定甲醇作为沉淀剂，因为甲醇较之其他溶剂沉淀效果好。然后用水、甲醇、流动相、乙醇作为复溶溶剂，发现用甲醇做复溶溶剂提取率较高，能明显提高检测限。
参考文献
[1] 朱 毅，刘国雄，黄燮南.钩藤碱和异钩藤碱对豚鼠心房的负性变时和变力作用[J].中国药理学与毒理学杂志，1993，7(2)：11－12.
[2] 孙安盛，吴 芹，刘国雄，等，异钩藤碱合用双肼苯哒嗪对清醒动物的降压效应及血流动力学的影响[J].中国西医结合">中西医结合杂志，1996，16(特辑)：45－47.
[3] 黄 彬，吴 芹，文国容，等.反相HPLC 法测定异钩藤碱的含量[J].药物分析杂志，1998，18(1)：49－50.
[4] 余俊先，石京山.反相高压液相色谱法测定家猫异钩藤碱的药动学及其代谢物[J].江苏大学学报(医学版)，2002，12(1)：8－12.
[5]王英锋，魏璐雪，王保中.钩藤生物碱实验动物体内药物分析[J].药物分析杂志，1999，19(1)：58－60.