【摘要】 目的 观察丹参酮ⅡA(Tan ⅡA)对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织及血清中一氧化氮(NO)含量、一氧化氮合酶(NOS)及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性的影响，探讨其对脑缺血再灌注损伤保护作用的可能机制。方法 将大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、Tan ⅡA低、高剂量组，线栓法建立局灶性脑缺血再灌注模型。Tan ⅡA高、低剂量组于术前连续灌胃给予高、低剂量Tan ⅡA 3 d，每日1次。各组于脑缺血90 min再灌注24 h后进行HE染色，观察病理形态学变化，检测脑组织和血清中NO含量和NOS、iNOS活性的变化。结果 Tan ⅡA高、低剂量组脑组织缺血损伤病理学改变明显轻于缺血再灌注组，Tan ⅡA高剂量组缺血改变亦轻于低剂量组。与假手术组比较，缺血再灌注组脑组织和血清中NO含量和NOS、iNOS活性明显升高；与缺血再灌注组比较，Tan ⅡA高、低剂量组脑组织和血清中NO含量和NOS、iNOS活性均明显降低，高、低剂量组之间差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论 Tan ⅡA可减轻神经元损伤程度，对缺血再灌注脑损伤具有保护作用，其机制可能与降低NOS、iNOS活性，减少NO含量有关。
【关键词】 缺血再灌注损伤；一氧化氮；一氧化氮合酶；诱导型一氧化氮合酶；丹参酮ⅡA；大鼠
Abstract：Objective To study effect of Tanshinone ⅡA (Tan ⅡA) on the content of NO and the activities of NOS and iNOS in cerebral ischemia reperfusion (I/R) injury rats， and explore its protective mechanism. Methods Rats were randomly pided into 4 groups， which were sham operated group， I/R group， low dose Tan ⅡA treated group and high dose Tan ⅡA treated group. The focal middle cerebral arterymocclusion (MCAO) model was made by suture-occluded method. Rats were pretreated with Tan ⅡA， ig for 3 d before MCAO. After 90 min MCAO following 24 h of reperfusion， pathomorphologic changes was investigated with HE staining. The content of NO and the activities of NOS and iNOS was also determined. Result The change of ischemic impairment in low or high dose Tan ⅡA treated group was lighter than that of I/R group， and high dose Tan ⅡA treated group was lighter than that of low dose Tan ⅡA treated group. Compared with sham operated group， the content of NO and the activities of NOS and iNOS increased at 24 h of reperfusion in the ischemic territory (P＜0.05). Compared with I/R group， low and high dose Tan ⅡA treated group reduced the content of NO and the activities of NOS and iNOS dose-dependently (P＜0.05). Conclusion Tan ⅡA has protective effect on cerebral I/R injury by reducing the content of NO and the activities of NOS and iNOS dose-dependently.
Key words：ischemiareperfusion injury；NO；NOS；iNOS；Tanshinone ⅡA；rat
一氧化氮(NO)是机体内重要的信使分子和效应分子，为神经传递、血管舒张、调节神经功能的内源性介质，与神经系统的生理和病理过程关系密切[1]，而一氧化氮合酶(NOS)是NO生物合成的限速酶。丹参为唇形科鼠尾草属植物，具有活血化瘀、宁心安神等功效，目前在缺血性脑血管病的治疗中广为应用。有研究发现，丹参能下调缺血所致的NOS表达，使NO合成减少，减轻缺血性脑损伤[2]。本实验采用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，研究丹参酮ⅡA(Tanshinone ⅡA，Tan ⅡA)对大鼠脑缺血再灌注损伤脑组织和血清中NO含量和NOS、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性变化的影响，探讨其保护作用的可能分子生物学机制。
1 材料与方法
1.1 动物
健康Wistar大鼠，雄性，清洁级，共40只，体质量(250±30) g，广西医科大学动物实验中心提供。
1.2 分组及给药
将大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、Tan ⅡA低剂量组及Tan ⅡA高剂量组，每组10只。TanⅡA低剂量组(15 mg/kg)和高剂量组(30 mg/kg)均于术前连续灌胃给药3 d，每日1次，假手术组和缺血再灌注组给予等量的生理盐水灌胃。第3 日给药后1 h建立局灶性脑缺血90 min再灌注24 h动物模型。
1.3 造模
参照文献[3]方法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。采用颈外动脉插入线栓法，各组均进行左侧大脑中动脉栓塞。采用石蜡线栓，直径约0.27 mm，插入深度约18 mm，此时线栓头位于大脑中动脉起始部。缺血90 min时，抽提线栓实现再灌注。神经功能缺陷评分按照Longa等[3]评分标准，分数在1～3分为模型成功。
1.4 HE染色病理形态学观察
再灌注24 h，各组随机取5只大鼠，用生理盐水和多聚甲醛进行心脏灌流固定，断头取脑。在左侧大脑半球距离嗅球尖端7～11 mm之间冠状切取约5 mm厚脑组织块，固定、脱水、包埋成腊块，连续切片，厚5 μm。连取5张作HE染色，观察病理形态学改变。
1.5 指标检测
再灌注24 h，大鼠均内眦取血，置于干燥试管中，离心，然后将上清液置于干净EP管中，低温保存，用于测定NO、NOS和iNOS。取血完毕后立即将各组大鼠断头取脑，冰盘上快速取一侧大脑皮层，用冰冷生理盐水冲洗掉血液，滤纸吸干水分，于低温环境下称重，置于含有冰冷生理盐水的玻璃匀浆器中(匀浆器放入冰浴中)制成质量分数为10%的脑组织匀浆，然后放置于低温离心机中，4 ℃离心，取上清液，低温冰箱中保存，用于测定各指标。
1.6 统计学方法
数据处理采用SPSS11.5统计软件进行运算，结果以x±s表示，组间差异显著性检验采用方差分析。
2 结果
2.1 丹参酮ⅡA对脑组织病理学改变的影响
假手术组脑组织切片可见神经细胞、胶质细胞及毛细血管形态正常，结构完整，锥体细胞核大而圆，核仁明显。缺血再灌注组呈缺血改变，梗死区正常组织结构消失或结构不清，间质水肿，有炎细胞浸润；锥体细胞体积缩小，细胞核固缩深染，胞浆嗜伊红；部分细胞坏死，并可见呈筛状坏死的坏死灶。Tan ⅡA不同剂量治疗组脑组织缺血改变较缺血再灌注组明显减轻，坏死范围缩小，细胞结构较完整，细胞核固缩少，细胞间质水肿轻，高剂量组与低剂量组比较，缺血改变更轻。
2.2 丹参酮ⅡA对脑组织一氧化氮含量、一氧化氮合酶及诱导型一氧化氮合酶活性的影响
(见表1)表1 Tan ⅡA对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织NO、NOS和iNOS的影响（略）注：与假手术组比较，*P＜0.05；与缺血再灌注组比较，#P＜0.05；与Tan ⅡA低剂量组比较，△P＜0.05(下同)
2.3 丹参酮ⅡA对血清一氧化氮含量、一氧化氮合酶及诱导型一氧化氮合酶活性的影响(见表2)表2 Tan ⅡA对脑缺血再灌注损伤大鼠血清NO、NOS和iNOS的影响(略)
3 讨论
NO是生物体内重要的信使分子和效应分子，具有神经介质和调质的功能，广泛参与体内生理和病理活动。在脑缺血性损伤过程中，依据缺血及再灌注时间段及产生NO的细胞类型和产生NO过程等条件不同，NO可能发挥损伤或保护的双重作用。NOS作为NO合成的关键酶，可分为三种类型：第1种是神经元型(nNOS)，第2种为内皮结构型(eNOS)，它们的激活均依赖于钙离子和钙调蛋白的作用。第3种为诱导型，可由炎症因子、内毒素等诱导激活，iNOS作用时间长，可催化生成大量NO[4]。近年研究表明，在脑缺血再灌注损伤过程中，NOS是决定NO双重作用的关键。脑缺血后NOS活性在缺血各时期均有增高，但在缺血损伤的不同阶段，不同类型的NOS发挥不同的功能作用。脑梗死超早期(＜2 h)，eNOS活性升高，产生NO在局部扩张脑血管，增加脑血流，发挥脑保护作用，但超过2 h则作用消失。脑梗死早期(2～6 h)，nNOS产生大量NO发挥毒性作用，当脑梗死晚期(＞6 h)，iNOS产生的NO可加剧谷氨酸毒性，导致迟发性神经元损伤[5]，尤其iNOS与钙调蛋白结合紧密，产生大量的NO，更加剧了迟发性神经元死亡。本实验结果显示，脑缺血90 min再灌注24 h，缺血再灌注组大鼠脑组织和血清中NO含量、NOS及iNOS酶的活力均明显上升，提示NO的增加可能来源于nNOS和iNOS的活性增高，而升高的NO与NMDA受体结合使大量Ca2+通道开放，胞浆内Ca2+明显升高，引起细胞内钙超载，促发损伤级联反应。随着缺血再灌注损伤的发展和炎细胞的浸润，以及肿瘤坏死因子α、白细胞介素-β等细胞因子表达增加，可诱导iNOS产生增多，从而介导神经毒性作用，导致神经元进一步损伤[6]。
胡氏等[7]研究发现，Tan ⅡA能减小缺血再灌注损伤大鼠脑梗死体积。本研究结果也显示，脑缺血再灌注损伤给予Tan ⅡA治疗也可明显减轻缺血病理损害，高剂量Tan ⅡA的保护效果更显著，表明Tan ⅡA对缺血再灌注脑损伤有保护作用。我们的研究还显示，Tan ⅡA能减少脑组织和血清中NO的含量、降低iNOS和NOS活力，表明Tan ⅡA抑制NO作用可能主要是通过降低iNOS活性而实现的。
参考文献
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[7] 胡霞敏，周密妹，胡先敏，等.丹参酮ⅡA对脑缺血再灌注大鼠脑损伤的保护作用及对能量代谢的影响[J].中国临床药学杂志，2006，15(3)：176－179.