作者：佟海英，胡素敏，高学敏，周鹏，傅骞，杨佳
【摘要】 目的 观察中药复方对尾部悬吊模拟失重大鼠骨密度(BMD)、骨生物力学强度及组织形态计量学的影响。方法 50只Wistar大鼠按随机区组实验设计法分成正常对照组、模型组及悬吊中药低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组10只，实验周期21 d。实验结束后，取右侧股骨和第4腰椎，用双能X线骨密度仪测量股骨、腰椎BMD；三点弯曲实验法及腰椎压缩实验法分别测定股骨和腰椎生物力学指标；取第3腰椎，制作不脱钙切片测量骨形态计量学指标。结果 与正常对照组相比，模型组大鼠股骨、腰椎BMD明显降低(P＜0.05)，股骨最大载荷、弹性载荷、最大挠度、弹性挠度明显降低(P＜0.05)；腰椎最大载荷、弹性载荷明显降低(P＜0.05)；腰椎骨小梁体积百分比、骨小梁形成表面百分比、活性生成表面百分比、骨小梁矿化率明显降低(P＜0.05)。与模型组相比，中药中剂量组可明显增加模拟失重大鼠股骨BMD和腰椎最大载荷、弹性载荷和腰椎骨小梁体积百分比、骨小梁形成表面百分比、活性生成表面百分比、骨小梁矿化率(P＜0.05)。结论 中药复方能促进骨的形成和矿化过程，增加BMD以及增强骨力学强度，从而达到防治骨丢失的作用。
【关键词】 中药；模拟失重；骨密度；骨生物力学；骨组织形态计量学
Abstract：Objective To study the effects of Chinese medicine compound on bone density， biomechanics， histomorphometry of weightlessness rats simulated by tail suspension. Methods Fifty Wistar rats were randomly pided into 5 groups with 10 rats each group：control group， model group， and low dose， medium dose and high dose Chinese medicine compound treated suspension group， the experiment period was 21 days. BMD of femur and lumbar vertebrae were detected by dual energy X-ray absorptiometry. The femoral biomechanics parameters and anti-compress ability of lumbar vertebrae were measured by three-point assay and compress test respectively. The quantitative structures of non- decalcified bone tissue sections were analyzed by histomorphometry. Result Compared with control group， BMD of femur and lumbar of model group decreased remarkably (P＜0.05)， Maximum Load， Elastic Load， Maximum Deflection and Elastic Deflection of femoral bone and Maximum Load and Elastic Load of lumbar vertebrae of model group decreased remarkably (P＜0.05)， TBV%， TFS%， AFS% and MAR% of lumbar vertebrae of model group also decreased remarkably (P＜0.05). Compared with model group， BMD of femoral bone， Maximum Load and Elastic Load， TBV%， TFS%， AFS% and MAR% of lumbar of medium dose group increased remarkably (P＜0.05). Conclusion Chinese medicine compound can improve the bone formation， prevent bone loss by improving ossify， bone mineral deposition and mineralization， as well as increase BMD， improve the bone biomechanics property.
Key words：Chinese medicine；simulated weightlessness；BMD；bone biomechanics；bone histomorphometry
失重性骨丢失是长期航天飞行中最危险的因素之一，因而探讨和寻求有效的对抗失重骨丢失的有效措施一直是航天医学界的难题，但至今仍无切实有效的防护措施。我们将中医药理论应用于航天医学研究，研制了以滋补肝肾、健脾益气、活血化瘀、强筋健骨等治法为依据组成的中药复方，并利用尾部悬吊模拟失重动物模型，对其药理、药效和机理进行了全面系统的研究。本实验是该方对骨代谢影响系列研究的一个组成部分，重点探讨该方对模拟失重大鼠骨密度(BMD)、骨生物力学强度及组织形态计量学的影响，为研究中医药对抗模拟失重骨丢失措施及探讨中药对抗模拟失重骨丢失机理的研究奠定基础。
1 实验材料
1.1 动物
Wistar大鼠，雄性，体重(150±10)g，北京维通利华公司提供，合格证号：SCXK(京)2002-0003。适应环境7 d后进行实验。
1.2 药物
中药复方由刺五加、黄芪、当归、补骨脂等药按一定比例组成。全部药材经北京中医药大学中药教研室鉴定，按传统工艺煎煮，制成1 g原药材/mL浓度的口服液。
1.3 试剂
甲基丙烯酸甲酯(批号20061010)，北京益利精细化学品有限公司；邻苯二甲酸二丁酯(批号040401)，北京化学试剂公司；过氧化苯甲酰(批号20040610)，北京金龙化学试剂有限公司。
1.4 仪器
双能X线骨密度仪，美国LUNAR公司；WD-1型电子万能试验机，长春第二试验机厂；WDW-5型微机控制电子万能试验机，长春市朝阳试验仪器有限公司；Reicheit-Jung 2040切片机，德国。
2 实验方法
2.1 尾部悬吊模型的建立
采用陈氏等[1]改进的鼠尾悬吊法。将大鼠在悬吊笼中尾部悬吊，后肢离地，使躯干与地面成300°角，前肢着地可以自由活动。
2.2 分组及给药
Wistar大鼠按随机区组实验设计法分成正常对照组(K组)、模型组(M组)及悬吊中药低剂量组(D组)、中剂量组(Z组)、高剂量组(X组)共5组，每组10只，均用悬吊笼单笼饲养，实验周期21 d。造模前7 d悬吊中药3个剂量组给予中药复方(10 mL/kg)灌胃，K组、M组给予蒸馏水灌胃(10 mL/kg)，每日灌胃1次。第8日灌胃1 h后，M组与悬吊中药3个剂量组尾部悬吊，K组大鼠笼中自由活动。继续每日灌胃1次，每周称重1次，按重量调整给药剂量，连续灌胃14 d。
2.3 标本处理及检测
2.3.1 大鼠股骨、腰椎骨密度的测定
实验第21日处死大鼠，取右侧股骨和第4腰椎骨，去净附着结缔组织，分别用生理盐水纱布包裹后即刻保存于-70 ℃冰箱中，并尽快进行BMD测定。测定前取出上述样本，室温下复温，然后将各样本分别置于有机玻璃板上，固定位置，以全长的1/2交界处为测量点，应用双能X线骨密度仪作骨横越扫描，荧光屏显示测量图像，自动打印测量结果。
2.3.2 股骨、腰椎生物力学的测定
实验前取出冰箱保存的大鼠股骨，室温下复温，进行三点弯曲试验，跨距20 mm，加载速度2 mm/min，同时记录载荷-变形曲线；第4腰椎体进行压缩试验，加载速度为2 mm/min，同时记录载荷-变形曲线，2组样本均计算最大载荷和弹性载荷、最大挠度和弹性挠度。
2.3.3 腰椎组织形态计量学的测定
在实验动物处死前14、3 d分别皮下注射盐酸四环素30 mg/kg。大鼠处死后，迅速取出第3腰椎。剔净骨周围肌肉及软组织，用生理盐水擦洗干净，置于10%福尔马林中固定24 h，然后制作5 μm和10 μm的纵向不脱钙骨切片。5 μm切片用二甲苯溶掉树脂后，梯度乙醇至水，甲苯胺蓝染色；10 μm切片直接用于荧光观察。主要参数包括：骨小梁体积百分比、骨小梁吸收表面百分比、骨小梁形成表面百分比、活性生成表面百分比、骨小梁矿化率。
3 统计学方法
所测定指标均采用x±s表示，BMD和生物力学指标使用SPSS12.0统计软件中的方差分析(ANOVA)进行检验，骨组织形态剂量学使用Student-Newman方法进行检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
(见表1～表3)表1 中药复方对模拟失重大鼠腰椎骨组织形态计量学的影响(略)注：与K组比较，#P＜0.05；与M组比较，*P＜0.05；与Z组比较，ΔP＜0.05(下同)表2 中药复方对模拟失重大鼠股骨、腰椎BMD的影响((x±s，g/cm2)表3 中药复方对模拟失重大鼠股骨、腰椎最大载荷、最大挠度、弹性载荷、弹性挠度的影响(x±s)
5 讨论
我们的前期动物实验研究表明，尾部悬吊后大鼠出现了明显骨代谢异常，而在本实验中模型组大鼠股骨、腰椎BMD以及最大载荷、弹性载荷均显著减少，这与国内外的相关报道一致[2-3]，说明应用尾部悬吊大鼠的模型是成功的。
BMD是反映骨皮质厚度、骨小梁结构和骨量的重要指标，也是间接评价骨丢失程度的指标之一。本实验中，与正常对照组比较，模型组大鼠股骨、腰椎BMD明显降低，中药中剂量组可明显增加股骨BMD。说明尾部悬吊模拟失重时，后肢去负荷后肌肉萎缩、骨应力刺激消失、骨骼血液供应不足等引起大鼠承重骨骨矿盐大量丢失，给与中药干预后有可能增加骨骼血液供应以及刺激成骨细胞活性或抑制破骨细胞活性而促进大鼠的骨矿盐沉积，促进骨的矿化，增强BMD。但中药复方对股骨和腰椎BMD的药效有差异，可能与药物剂量、给药时间以及作用途径有关。
由于单纯骨矿盐含量测定不能表现骨结构和材料特征的变化，因此结合骨力学指标测定可以更全面评价骨质量，反映骨骼抗骨折能力。最大载荷和弹性载荷反映骨结构力学特性，他们的变化反映骨小梁质量、结构连续性和皮质厚度的改变[4]。挠度是骨骼柔韧性指标，其数值的大小与骨基质胶原蛋白含量高低有关。对于受试骨骼来说，单独考虑挠度并不能说明受试骨骼的质量，应根据具体的情况来综合分析。失重及模拟失重下骨骼力学特性(如硬度、强度、柔韧性、弹性及扭转力)皆有下降，尤其是扭转力的下降最为显著。Cosmos飞行发现大鼠股骨和脊柱的力学性能下降[5]。马氏等[6]于尾吊大鼠模型模拟失重90 d后测量长骨的生物力学性能发现，股骨的强度、硬度、刚度各项参数均较对照显著下降。在本实验中，模型组大鼠股骨、腰椎力学强度均降低，中药中剂量组可明显增加腰椎最大载荷和弹性载荷。提示中药复方通过增加BMD，增强骨力学强度而有效防止骨折发生，而对最大挠度和弹性挠度没有显著影响，可能与中药复方对骨基质胶原蛋白含量影响不明显有关。
在本实验中，中药复方中剂量组比低剂量组和高剂量组更明显增加BMD和骨力学强度，因此，我们选择中药复方中剂量组，从骨组织形态计量学方面进一步考察了该方的疗效。骨组织形态计量学是新近发展起来的一种骨组织定量研究方法，它将骨组织切片中二维图像展示的骨组织形态转化为数量资料，从而得出较多的定量结构信息，可从组织和细胞水平了解骨结构的变化情况。而骨组织的力学特征不仅决定于骨质的密度，还与骨小梁的微观结构有着非常密切的关系。目前有关骨形态及结构的研究证明，失重状态下骨结构的变化包括骨小梁变薄、数目减少、成骨细胞的数目和活动减少等[7]。本实验结果表明，模型组大鼠骨小梁结构及其形态发生明显改变，骨小梁明显变细，骨小梁体积百分比、骨小梁形成表面百分比、活性生成表面百分比、骨小梁矿化率明显降低，部分骨小梁中断而逐渐被吸收，骨小梁之间的距离变宽，骨小梁的连接遭到破坏，失去原来的三维网架结构，导致松质骨的整体力学强度下降。提示模拟失重可抑制大鼠松质骨类骨质的形成和矿化，对骨吸收影响不大，表明模拟失重使骨形成减少而导致骨的丢失。经中药治疗后，骨小梁数目增加、变粗、间隙减小，骨小梁体积百分比和形成表面百分比及矿化率等明显增加，表明中药复方能明显的促进模拟失重大鼠类骨质的形成和矿化，改善骨的显微结构，从而增加了骨量和提高了骨的强度。
综上，中药复方可以有效改善失重性骨丢失，有效促进骨的形成和矿化过程，增加BMD以及增强骨力学强度，从而达到防治骨丢失的作用。表明该中药复方对防治失重性骨丢失方面具有一定的应用意义，有待于细胞水平和分子水平的深入研究。
参考文献
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