作者：胡木林，王忠，李涛，张小燕，荆志伟，周才秀，苏莉雅
【摘要】 目的 探讨N5，N10亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T多态性与缺血性中风病血瘀证易感性的关系。方法 收集缺血性中风病血瘀证患者84例(病例组)，缺血性中风病非血瘀证患者143例(对照组)，抽外周静脉血提取DNA，采用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)检测MTHFR基因C677T多态性类型。结果 2组MTHFR基因C677T基因型频率分布差异有统计学意义(χ2＝12.618；d.f.＝2，P＝0.002)，突变型等位基因频率病例组高于对照组(分别为39.29%和24.48%)，TT基因型与缺血性中风血瘀证发生显著相关(OR＝3.730；95%CI为1.229～11.318；P＝0.014)。结论 MTHFR基因TT型可能是缺血性中风病血瘀证发病的易感危险因素之一。
【关键词】 缺血性脑卒中；血瘀证；亚甲基四氢叶酸还原酶；基因；单核苷酸多态性
Abstract：Objective To explore the relationship between the C677T single nucleotide polymorphism of N5， N10-methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) and blood stasis syndrome (BSS) of ischemic stroke (IS). Methods The MTHFR C677T genotypes in 84 patients of IS of BSS type (BSS-IS group)， 143 patients of IS of non-BSS type (non-BSS-IS group) were determined by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) assay. Results The constituent ratio of MTHFR CC， CT and TT genotype was significantly different between two groups (χ2＝12.618；d.f.＝2， P＝0.002). The frequencies of T allele in patients with BSS-IS (39.29%) were higher than that of non-BSS-IS group (24.48%). The MTHFR TT genotype was associated with a 3.730-fold increased risk for BSS-IS (OR＝3.730；95%CI， 1.229～11.318；P＝0.014). Conclusion The MTHFR TT genotype may be one of the risk factors associated with the susceptivity to BSS-IS.
Key words：ischemic stroke；blood stasis；methylenetetrahydrofolate reductase；gene；single nucleotide polymorphism
中风病是一种高致死、高致残的神经系统疾病，已经成为威胁人类健康的主要杀手之一，其中大约80%的中风是缺血性的[1]。众所周知，血瘀是中风病重要的致病因素和病理产物之一，临床治疗中风病未有不治瘀者，瘀血说在目前占主导地位。中医证候是中医药理论体系的基石，具有“内实外虚”及多样性、时空可变性等特征，是中医药理论的特色与优势所在，因而，证候疗效的研究是中医药现代化与国际化的关键性课题。以前的研究从器官、细胞、分子层次上开展了大量的工作，但由于指标的特异性和灵敏性等问题制约了证候的客观化、标准化及相应的疗效判断研究。目前，人类功能基因组学的迅速发展，已成功地发现、克隆了一些疾病或性状的候选基因，为中医证候的基因组学研究，为证候候选基因及其分型研究，为客观地开展临床证候的分型(表型)研究提供了机遇。笔者对缺血性中风血瘀证与N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T多态性的相关性进行了研究。现报道如下。
1 资料与方法
1.1 研究对象
疾病标准采用1995年中华医学会第四次全国脑血管病学术会议通过的“各类脑血管疾病诊断要点”中的脑梗死诊断标准[2]；辨证标准参照国家中医药管理局脑病急症科研组制定的“中风病辨证诊断标准(试行)”(1993年)[3]。
纳入标准：①符合缺血性中风诊断；②经头颅CT或头颅MRI确诊为脑梗死。
排除标准：①短暂性脑缺血发作；②检查证实由脑肿瘤、脑外伤、脑寄生虫病、代谢障碍、风湿性心脏病、冠心病及其他心脏病合并房颤引起脑栓塞者；③合并有肝、肾、造血系统和内分泌系统等严重原发性疾病，精神病患者。
其中84名缺血性中风血瘀证患者设为病例组，男54例，女30例，平均年龄(65.30±10.28)岁；对照组为缺血性中风非血瘀证患者共143例，男85例，女58例，平均年龄(62.90±11.26)岁。
1.2 方法
1.2.1 人基因组DNA提取
缺血性中风病患者全血血样由中国中医科学院西苑医院神经内科提供。采用Wizard Genomic DNA Purification Kit(Promega公司)试剂盒抽提全血基因组DNA。
1.2.2 MTHFR基因型检测
应用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性(Polymerase chain reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-PELP)方法。上游引物：5’CAAAGGCCACCCCGAAGC3’，下游引物：5’AGGACGGTGCGGTGAG AGTG3’，由上海生物工程公司合成。PCR总反应体系50 μL：上下游引物各2 μL(10 μmol/L)，DNA模板2 μL(20～30 ng/μL)， 10×PCR缓冲液5 μL，4×dNTP混合液4 μL，Pfu酶：0.25 μL (5 U/μL)，去离子水35 μL。PCR程序为：①94 ℃，5 min，预变性；②94 ℃，30 s，变性；③57 ℃，30 s，退火；④72 ℃，
延伸1 min；②、③、④步骤30个循环；⑤72 ℃，10 min，延伸。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，荧光染色，紫外凝胶成像系统下观察。酶切反应体系酶切反应体系：BufferR＋2 μL，PCR扩增产物5 μL，MBI Fermentas HinfⅠ1 μL，去离子水12 μL。37 ℃酶切24 h后2%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。PCR扩增仪，GeneAmp PCR System 9600型，购自美国PE公司。PCR所用相关试剂(Taq酶、dNTP、MgCl2)购自中国大连宝生物工程有限公司。电泳仪及凝胶成像系统，上海复日科技有限公司产品。
1.2.3 统计学方法
采用SPSS10.0统计软件对数据进行统计学处理。临床表型计量资料组间比较用t检验，计数资料组间比较用χ2检验，用比值比(odds ratio，OR)和95%置信区间(95%confidential interval，95%CI)来表示基因型和缺血性中风血瘀证发生的关联性。P＜0.05认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 基线情况分析
病例组与对照组在性别和年龄构成上差异均无统计学意义(P值分别为0.469和0.111)。
2.2 MTHFR基因C677T多态性电泳结果
扩增结果和基因型分析MTHFR扩增目的片断大小为246 bp (见图１)。根据HinfⅠ酶切片断的情况，MTHFR有3种基因型，即野生型CC不被酶切，只含有246 bp一种片段，纯合突变型TT被酶切成174 bp和72 bp 2种片段，杂合突变型CT一条DNA被酶切，另一条未被酶切，含有174、72、246 bp 3种片段(见图2)。
2.3 Hardy-Weinberg平衡的验证
MTHFR基因C677T，对照组χ2＝2.603，P＝0.106＞0.05，病例组χ2＝1.838，P＝0.175＞0.05。所调查人群基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，实际检出基因型频率数与预期基因型频率数基本一致，证明本研究人群已达到遗传平衡，具有群体代表性。
2.4 MTHFR基因C677T多态性与缺血性中风血瘀证的相关性
研究显示，MTHFR基因C677T基因型分布在2组之间差异有统计学意义(χ2＝12.618；d.f.＝2，P＝0.002)，突变型等位基因频率病例组高于对照组(分别为39.29%和24.48%)。CC基因型在2组分布有差异(P＝0.002)，是缺血性中风血瘀证发生的一个保护因素(OR＝0.417；95%CI，0.238～0.730)；TT基因型与缺血性中风血瘀证发生有显著相关(OR＝3.730，P＝0.014)，且是一个危险因素。见表1。表1 MTHFR基因C677T的基因型与等位基因频率分布（略）
3 讨论
血浆中同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)水平过高会引发动脉粥样硬化型脑血管病，是脑卒中的独立危险因素[4]，同时与血瘀因素有明显相关[5]。由于Hcy再甲基化反应需HTHFR作为关键酶参与，因而MTHFR基因的遗传变异可通过改变血浆同型Hcy的水平，从而改变机体对某些疾病的易感性，特别是血清叶酸水平较低及维生素B6摄入较少者。丹麦最近一项研究显示，Hcy浓度受遗传因素影响很大，遗传度随着年龄的增大而降低，其中MTHER基因的变异几乎占据了全部，只有很少一部分影响由其他变异导致[6]。人MTHFR基因定位于常染色体1p36.3上，包括11个外显子和10个内含子，cDNA全长2.2 kb，其中第4外显子的C677T(A1a→Va1)碱基突变最为常见。我们的研究结果表明，MTHFR基因CT型与缺血性脑卒中发生呈正相关。其分子机制可能是变异可产生Hinf Ⅰ限制酶酶切位点，使MTHFR热敏感性改变而致酶活性改变。
典型的血瘀证病理变化是血栓形成，本研究结果显示， MTHFR基因TT基因型可能是缺血性中风血瘀证发病的易感危险因素之一。其机制可能是：C677T多态性引起的高Hcy血症可损伤内皮细胞和血管平滑肌细胞，诱导内皮细胞激活促凝因子，促进纤溶酶原激活物抑制剂的表达，下调硫酸肝素的合成和血栓调节素的表达，抑制组织型纤溶酶原激活物的合成，及抑制与血管内皮结合，而干扰了内皮纤溶活性，促进血小板粘附聚集功能和组织因子活性，激活凝血酶Ⅴ、Ⅶ等，使机体处于高凝状态，从而促进血栓形成[7]。进一步的研究中，我们应加大样本量，明确临床表型和与之相匹配的对照组。
脑血管病和证都属于多基因疾病，他们的发生受多种因素的影响，即使该基因确实与疾病或证相关也可能会得出相反的结论。因此，在研究此类疾病和证时，我们认为不仅应考虑到病人整体情况及伴随疾病的影响，还应注意到人种、人群、统计方法的差别，并进一步增加候选基因，探究多个SNPs之间或SNPs与环境因子之间的相互作用，以利对疾病和证的全面认识。
参考文献
[1] Dichgans M. Genetics of ischaemic stroke[J]. Lancet Neurol，2007， 6(2)：149－161.
[2] 全国第四届脑血管病学术会议.各类脑血管疾病诊断要点[J].中华神经科杂志，1996，29(06)：379－380.
[3] 国家中医药管理局脑病急症科研组.中风病辨证诊断标准(试行)[J].北京中医药大学学报，1994，17(3)：64－66.
[4] Homocysteine Studies Collaboration. Homocysteine and risk of ischemic heart disease and stroke：a meta-analysis[J]. JAMA，2002， 288(16)：2015－2022.
[5] 严 卉，胡晓晟.血浆同型半胱氨酸和冠状动脉粥样硬化严重程度与中医证型的关系[J].中国西医结合">中西医结合杂志，2002，22(11)：813－815.
[6] Bathum L， Petersen I， Christiansen L， et al. Genetic and environmental influences on plasma homocysteine：results from a Danish twin study[J]. Clin Chem，2007，53(5)：971－979.
[7] Cook JW， Taylor LM， Orloff SL， et al. Homocysteine and arterial disease. Experimental mechanisms[J]. Vascul Pharmacol，2002， 38(5)：293－300.