作者：朱德增，殷桂香，曹玉莉
【摘要】 目的 以氨基胍(AG)为对照，观察酸味中药复方对2型糖尿病大鼠心肌组织晚期糖化终产物(AGEs)含量及受体(RAGE)基因表达的影响，探讨其防治糖尿病心肌病变的机制。方法 采取腹腔注射链脲佐菌素(STZ)配合高热量饮食的方法建立糖尿病动物模型。成模后随机分为模型组、AG组、中药组。给药8周和12周后分别采用荧光法和荧光定量PCR法检测心肌组织AGEs含量和RAGE基因表达量。结果 糖尿病大鼠心肌组织AGEs含量和RAGE基因表达量明显高于正常组(P＜0.05)；中药组和AG组AGEs含量和RAGE基因表达量明显低于模型组(P＜0.05)。结论 酸味中药复方可能通过抑制大鼠心肌组织AGEs形成和下调RAGE基因表达实现对高糖状态下心肌组织保护作用。
【关键词】 2型糖尿病；心肌组织；晚期糖化终产物；糖化终产物受体；基因表达；大鼠
Abstract：Objective To investigate the possible mechanism of Compounded Sour Medicinal Herbs (CSMH) in preventing and amelioration type 2 diabetic mellitus (T2DM) rats chronic complication， by analyzing the effects of CSMH on the deposition of advanced glycation end products (AGEs) and gene expression of their receptor myocardial tissue in T2DM rats. Methods The rats were injected with streptozotocin (STZ) through peritoneum， and fed with high-fat and high-caloric diets to induce T2DM animal models. Then the rats were randomly pided into three groups：untreated group (model group)， AG treated group and CSMH treated group. The deposition of AGEs and gene expression of RAGE in the myocardial tissue of T2DM rats were detected separately by fluorescence and real time PCR method. Results The deposition of AGEs and gene expression of their receptor in myocardial tissue in control group were lower than that of T2DM rats (P＜0.05). After treated， the deposition of AGEs and gene expression of their receptor in myocardial tissue in CSMH treated group were decreased compared with that of untreated group (P＜0.05)， and were equivalent to that of AG treated group. Conclusion CSMH can decrease the quantity of AGEs accumulation and down-regulated its receptor gene expression in the myocardial tissue in T2DM rats.
Key words：type 2 diabetic mellitus；myocardial tissue；AGEs；RAGE；gene expression；rat
糖尿病心肌病是以收缩和舒张功能障碍为特征的特异性心肌病，容易发生充血性心力衰竭[1-2]，临床尚无特效药物。动物实验证实，晚期糖化终产物(AGEs)在糖尿病心肌病的发生发展过程中扮演着重要角色，阻断其作用可减弱糖尿病所致的心肌组织结构损伤[3]。本研究以蛋白质非酶糖化终产物AGEs生成抑制剂氨基胍(AG)为对照，观察了酸味中药复方对2型糖尿病大鼠心肌组织AGEs形成及其受体(RAGE)mRNA表达的调节作用。
1 材料与方法
1.1 主要药物、试剂及饲料
酸味中药复方，由乌梅、吴茱萸、白芍、山楂、五味子按3︰3︰3︰4︰3的比例组成，长海医院药学部制成浸膏(1 g浸膏含2.21 g原药材)，置于-20 ℃冰箱保存，用时以蒸馏水稀释成含浸膏0.83 g/mL的稀释液。链脲佐菌素(STZ)、AG均为Sigma公司产品。羟脯氨酸检测试剂盒，南京建成生物工程研究所。Real time PCR Master Mix、DNA 100 bp均为Marker TOYOBO Biotech产品。Trizol Reagent，Invitrogen产品。cDNA合成试剂盒， Promega产品。PCR试剂盒，Sangon产品。RAGE引物、GAPDH引物，上海生物工程公司合成。高脂高热量饲料购自上海中国科学院实验动物中心(蔗糖6%、猪油15%、胆固醇1%、蛋黄粉13%、基础饲料65%)。
1.2 主要仪器
SCR20BB型高速低温离心机，HITACHI公司产品。BIO RAD Icycler 5荧光定量PCR仪。PTC-200PCR仪，MJ Resear公司产品。Smart Spec-3000紫外分光光度计，Biorad公司产品。GELMate 2000电泳系统，TOYOBO Biotec公司产品。GIS数码凝胶图像处理系统(配软件)，上海天能科技有限公司。
1.3 造模及分组
选用6周龄清洁级雄性SD大鼠，体重(180±20)g，动物合格证号：SCXK(沪)2007-0005。随机取25只为正常对照组，给予普通饲料喂养。其余的给予高脂高热量饲料喂养2个月后，筛选葡萄糖耐量实验(OGTT)异常者按剂量40 mg/kg一次性腹腔注射1%的STZ柠檬酸缓冲液，正常对照组给以同体积柠檬酸缓冲液腹腔注射。48、72 h连续2次空腹血糖(FBG)≥16.7 mmol/L为模型建立成功。造模成功的大鼠随机分为模型组、中药组、AG组。各组大鼠灌胃给药，中药组：15 g/(kg·d)，AG组：0.1 g/(kg·d)，正常组和模型组给予同体积生理盐水，每日2次。给药8、12周后观察相关指标的变化。
1.4 标本采集和指标检测
大鼠禁食12 h后，各组随机取5只，腹主动脉取血，分离血清，葡萄糖氧化酶法测FBG，全自动生化仪测血清果糖胺(FMN)，并立即分离心肌组织置入液氮中保存，用于AGEs含量及RAGE基因表达检测。
1.5 晚期糖化终产物含量测定
参照文献[4]方法，取心肌组织进行匀浆、离心、水洗、消化后，用荧光分光光度计在370/440 nm(发射波长/激发波长)
处测定消化液荧光强度。以HEPES缓冲液荧光值为1个任意荧光单位(AU)，样品荧光强度依此折算。消化液中羟脯氨酸含量用羟脯氨酸试剂盒测定。AGEs含量以每1 mg羟脯氨酸所含的荧光强度为1个任意单位。
1.6 晚期糖化终产物受体基因表达量测定
Trizol法抽提出心肌组织总RNA，紫外分光光度计测定其OD值，用A260和A280比值确定RNA纯度。电泳察看RNA浓度和完整性，RNasin除去基因组DNA。RNA的反转录：各样本取2 μL的RNA，反转录合成cDNA。反转录反应体系：RNA(2 μg) Primer(oligo-dT)1 μL，RNasin抑制剂0.5 μL，5×RT Buffer
4 μL、dNTP Mix(10 mM each)1 μL、RNasein 0.5 μL、MMLV反转录酶(100 U/μL)1 μL，补DEPC水至终体积20 μL。cDNA的荧光定量PCR扩增：荧光定量Master MIX(含SYBR荧光染料)27 μL，25 pmol引物1 μL(实验中所用引物见表1)，模板1 μL， CDNA Template：1 μL(200 ng)，总体积30 μL。扩增条件：95 ℃预变性３ min，然后95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s扩增50个循环，最后72 ℃延伸5 min，55 ℃→95 ℃绘制溶解曲线。荧光定量PCR分析软件对结果进行分析。见表1。表1 扩增引物及产物片段（略）
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1.7 统计学方法
所有数据均以x±s表示。采用SPSS11.5统计软件，选择方差分析进行方差齐性检验，多组均数间两两比较采用Student- Newman-Keuls法，若方差不齐采用秩和检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
(见表2、表3)表2 8周时FBG、血清FMN、心肌组织AGEs含量及RAGE基因表达量(略)注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05(下同)表3 12周时FBG、血清FMN、心肌组织AGEs含量及RAGE基因表达量(略)
3 讨论
糖尿病时持续高血糖所致蛋白质非酶糖基化在糖尿病心肌病诸多因素中倍受关注。研究表明，高血糖通过氧化应激反应，使心肌组织AGEs生成增多，并与其受体相互作用，可启动细胞信号转导的级联反应，导致心肌纤维化[5]。AGEs与单核细胞表面特异性受体RAGE结合后，还可促使单核细胞释放多种细胞因子及生长因子，增加内皮细胞通透性及单核细胞趋化性，并促进血管增生[4，6-8]，其中转化生长因子的释放可促进细胞肥大和间质纤维化，在心肌肥厚和纤维化中可能起重要作用[9-10]。另有研究表明，AGEs与RAGE结合后，还可通过直接影响心肌细胞钙离子浓度导致心肌收缩和舒张功能障碍[11]。而收缩和舒张功能障碍是糖尿病心肌病的主要特征。另外，AGEs通过修饰结构蛋白导致的心肌硬化、顺应性降低以及心肌细胞收缩蛋白(肌动蛋白和肌球蛋白)及钙调蛋白的异常糖基化，均可引起心脏舒张期延长和心肌细胞收缩力下降[12]。糖基化产物是血清白蛋白与葡萄糖结合而形成的高分子酮胺结构，是糖基化反应的中间产物。
AG是目前公认的作用最强的糖基化阻断剂，无论在体内、体外皆有抑制AGEs形成的作用[13]，但由于AG的毒副作用，目前临床还未能使用[14]。研究表明，中药及其活性成分可通过降低血脂、改善血液流变性、清除氧自由基、抑制醛糖还原酶的活性、抑制蛋白质非酶糖基化及改善血管舒张功能等途径对糖尿病血管病变起一定的防治作用[15]。
中医学中没有“糖尿病”病名，根据其临床表现当属“消渴”范畴，其病机根本为阴虚燥热，与血瘀有关。酸味中药复方由乌梅、吴茱萸、白芍、山楂、五味子组成，具有养阴生津的功效，方中的山楂还兼具活血化瘀的功效，与糖尿病的病机理论相符。从理论上推论，该方可能具有防治糖尿病及其慢性并发症的作用，我们以往的研究结果也证实了这一点[16-18]。本实验结果表明，经治疗后，酸味中药组糖尿病大鼠血糖水平明显低于模型组，AG组高血糖状态并没有得到明显改善，与多数文献报道相符。本实验还表明，AG不仅可抑制AGEs的形成，也可抑制早期糖基化产物的形成。非酶糖化反应是在高血糖的状态下产生的，酸味中药复方具有降血糖功效，理论上说，应该具有抑制血清中糖基化产物形成的作用。但本实验表明，酸味中药组血清糖基化产物水平虽然呈现下降趋势，但未达到统计学水平，可能与用药剂量、血糖控制水平有关，提高药物剂量是否会达到统计学水平尚待进一步研究。不过，酸味中药复方在减少AGEs在心肌组织的沉积、下调RAGE高表达、阻断AGEs的病理效应方面效果与AG相当。这也说明了酸味中药复方可能通过影响早期糖基化产物形成后的某一环节或某几个环节来实现其抑制AGEs的生成作用，同时也说明该复方可能和AG一样，可直接抑制蛋白非酶糖基化产物的形成，下调糖尿病大鼠心肌组织RAGE的过度表达。已有的体外实验也证实，酸味复方中的许多中药如吴茱萸、五味子等具有直接抑制非酶糖化的作用[19]。
阻断机体内蛋白糖基化的途径之一是有效降低血糖浓度，二是特异性阻断AGEs的形成。酸味中药复方既可有效控制血糖浓度，又可阻止蛋白糖基化的进程，减少AGEs的形成，下调RAGE基因的过度表达，这可能是该方防治糖尿病心肌病的机制之一。
参考文献
[1] Feuvray D. Diabetic eardiomyopathy[J]. Arch Mal Coeur Vaiss， 2004，97(3)：261.
[2] Tarantini L， Di Lenarda A， Velussi M， et al. Diabetes mellitus， left ventricular dysfunction and co ngestive heart failure[J]. Ital Heart J Suppl，2004，5(8)：605.
[3] Candido R， Forbes JM， Thomas MC， et a1. A breaker of advanced glyeation end products attenuates diabetes induced myocardial structural changes[J]. Cire Res，2003，92(7)：785.
[4] Yonekura H， Yamamoto Y， Sakurai S， et a1. Roles of the receptor for advanced glycation end products in diabetes induced vascular injury[J]. J Pharmacol Sci，2005，97(3)：305－311.
[5] Aragno M， Mastrocola R， Alloatti G， et a1. Oxidative stress triggers cardiac fibrosis in the heart of diabetic rats[J]. Endocrinology，2008，149(1)：380－388.
[6] Yamamoto Y， Yamagishi S， Yonekura H， et a1. Roles of the AGE-RAGE system in vascular injury in diabetes[J]. Ann N Y Acad Sci，2000， 902(5)：163－172.
[7] Chiaretti F， Santilli F， Mohn A. Role of growth factors in the development of diabetic complications[J]. Horm Res，2000，53(2)：53－67.
[8] Aso Y， Inukai T， Tayama K， et a1. Serum concentrations of advanced glycation endproducts are associated with the development of atherosclerosis as well as diabetic microangiopathy in patients with type 2 diabetes[J]. Acta Diabetol，2000，37(2)：87－92.
[9] Schaper J， Elsasser A， Kostin S. The role of cell death in heart failure[J]. Circ Res，1999，85(9)：867－869.
[10] Khan R. Examining potential therapies targeting myocardial fibrosis through the inhibition of transforming growth factor- beta 1[J]. Cardiology，2007，108(4)：368－380.
[11] Petrova R， Yamamoto Y， Muraki K， et al. Advanced glycation endproduct-induced calcium handling impairment in mouse cardiac myocytes[J]. J Mol Cell Cardiol，2002，34(10)：1425－1429.
[12] Montagnani M. Diabetic cardiomyopathy：how much does it depend on AGE[J]. Br J Pharmacol，2008，154(4)：725－726.
[13] 程梅芬，肖 洁，周丽诺，等.蛋白体外非酶糖化及氨基胍、二甲双胍的抑制作用[J].上海医科大学学报，1998，25(1)：35－37.
[14] Edelstein D， Brownlee M. Mechanistic studies of advanced end product inhibition by aminoguanidine[J]. Diabetes，1992，41(1)：26－29.
[15] 方朝晖，章小平，鲍道林，等.参丹健胰丸对糖尿病大鼠肾醛糖还原酶活性的影响[J].西医结合">中西医结合学报，2004，2(2)：126－128.
[16] 朱德增，陶凯忠，张传森.酸味中药复方对糖尿病大鼠动脉硬化的作用[J].浙江中医学院学报，2002，26(2)：38.
[17] 周亚兵，朱德增，罗若茵，等.酸味中药复方对2型糖尿病大鼠糖代谢的调节作用[J].成都中医药大学学报，2004，27(1)：13－16.
[18] 周亚兵，罗若茵，赵 莉，等.酸味中药复方对实验性2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的影响[J].中国中西医结合杂志，2005，25(5)：441－444.
[19] 许惠琴，朱 荃，李 祥，等.7味中药对体外非酶糖化产物生成的抑制作用[J].中草药，2002，33(2)：145－147.