作者：章丽华 张利平 胡锦群 冯丽娟 张龙清 张莅峡
【摘要】 ：目的 建立红毛五加中多糖的含量测定方法。方法 采用3，5-二硝基水杨酸比色法(DNS法)，测定红毛五加中的还原糖和总糖的含量，并计算出总多糖的含量。结果 以葡萄糖为对照品，线性范围为46.6～233.0 mg/L(r＝0.999 2)，加样回收率为99.0%～102.1%；红毛五加中总多糖含量1.3～1.9 mg/g。结论 本方法灵敏、稳定、重复性好，有助于红毛五加质量控制方法的研究。
【关键词】 红毛五加多糖 葡萄糖 3，5-二硝酸水杨酸比色法
Abstract：Objective To establish a method for the quantitative determination of AGP (Acanthopanax giraldii Harms polysaccharides). Methods AGP content was determined by DNS Method. The absorptions of processed samples were tested at the wavelength of 520 nm. Results Contrast to glucose， the linear range was 46.6～233.0 mg/L (r＝0.999 2)， the average recovery was 99.0%～102.1%， RSD＝3.52%， n＝5. The polysaccharides measured in 3 batches of samples were 1.3～1.9 mg/g. Conclusion The method is sensitive， steady with good repeatability， and help to the qulity control of Acanthopanax giraldii Harms.
Key words：Acanthopanax giraldii Harms polysaccharides (AGP)；glucose；DNS method
红毛五加(Acanthopanax giraldii Harms)是五加科五加属植物，主产于我国四川省[1-2]。四川省的红毛五加资源丰富，蕴藏量大，每年春天采收茎枝后，翌年仍生长茂盛。红毛五加与其它五加科植物不同，药用部位为茎皮，这对野生植物资源的保护无疑是十分有益的。我国已故著名的生药学家楼之岑先生在《常用中药材品种整理和质量研究》一书中建议将红毛五加列为《中华人民共和国药典》品种[3]，目前尚未实现，但研究工作在不断深入，近几年来对红毛五加的研究进展较快，取得许多成果。化学成分研究表明，红毛五加主含挥发油、皂苷类、木脂素类、核苷类、多糖类、氨基酸、有机酸及微量元素等多种活性成分。药理作用研究证实，其具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗辐射、保肝、调节心脑血管及机体免疫功能作用等[4-7]。红毛五加活性成分之一的多糖类对免疫调节作用、抗肿瘤及抗病毒作用尤为突出，并在临床得以证实[8]。为有效地控制药材质量，一般选用苯酚-硫酸法或硫酸蒽酮比色法[9-10]进行总糖测定，因总糖中包括单糖和多糖，不能明确地表明其中的多糖含量。另外，硫酸具有较强的腐蚀性，给实验操作带来极大不便。本试验采用3，5-二硝基水杨酸比色法(DNS法)[11-12]，以葡萄糖作为对照品，通过测定总糖及还原糖的含量，计算出多糖含量。本法灵敏、稳定、重复性好，适用于含多糖类中药的质量控制研究。
1 材料
1.1 多糖的分离与提取
取红毛五加皮，经粉碎，过40目筛，称取500 g，加适量水湿润2 h，装入渗漉筒中，加水浸没药材，浸渍6 h后，开始渗漉。以5 mL/(min·kg)的漉速渗漉，收集8倍量的渗漉液，减压浓缩至相对密度1.04～1.06(室温)。加乙醇沉淀，使最终含醇量达70%，静置，分层后分离，取醇沉物进行真空干燥(60 ℃以下)，得浅黄色红毛五加多糖提取物，经3批红毛五加多糖提取，其提取率分别为1.40%、1.20%、1.41%。
1.2 仪器、试剂及药材
UV-2550型紫外-可见分光光度计，SHIMADZU(日本)生产。
无水葡萄糖(含量测定用，批号0833-9501)，中国药品生物制品检定所提供；3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂，上海润捷化学试剂有限公司产品；所用其它化学品试剂均系分析纯。
DNS试液的配制：称取6.3 g DNS和262 mL 2 mol/L氢氧化钠溶液，加到500 mL含有182 g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5 g结晶酚和5 g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1 000 mL，贮于棕色瓶中，7 d后使用。
红毛五加药材购自成都市，由中国中医科学院中药研究所谢宗万研究员鉴定为红毛五加茎皮。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 对照品浓溶液的制备
精密称取105 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖适量，置50 mL容量瓶中(1 mg/mL)，加水定容至刻度，混匀，置4 ℃冰箱保存备用。
2.1.2 对照品稀溶液的制备
分别取上述浓对照品液若干(1～5 mL)置25 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，备用。
2.1.3 还原糖供试品溶液的制备
精密称取本品约40 mg，置25 mL量瓶中，加适量水振摇，使其充分溶解，并用水稀释至刻度，摇匀，过滤，弃初滤液，取续滤液，备用。
2.1.4 总糖供试品溶液的制备
精密称取本品约40 mg，置50 mL磨口三角瓶中，加盐酸(1→2)10 mL，置沸水浴中10 min，取出放冷后，加40%氢氧化钠溶液调pH至中性，移入50 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，过滤，弃初滤液，取续滤液，备用。
2.1.5 空白溶液的制备
取蒸馏水，与对照品溶液同时同法处理即可。
2.2 样品测定
精密量取上述对照品稀溶液、还原糖、总糖供试品溶液及空白溶液各2 mL，分别置10 mL容量瓶中，各加入DNS试液1.5 mL，摇匀，置沸水浴中加热5 min，取出，立即放入冰水中，冷却30 min，加水至刻度，摇匀，照分光光度法[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录VA]在520 nm波长处分别测定吸收度，计算总多糖的含量，即得。
2.3 DNS比色法试验条件的选择
2.3.1 检测波长的选择
分光光度计经空白溶液校准后，先后取上述对照品溶液、还原糖供试品及总糖供试品待测溶液进行全波段(360～900 nm)扫描，结果经比较分析，考虑取干扰较少、测定稳定且灵敏度较高的520 nm作为测定波长为宜。
2.3.2 称样量大小对测定还原糖及总糖的影响
参照“2.2”项测定，除称样量大小改变外，其它测定条件不变。结果表明，称样量取30～40 mg范围影响不大。称样量过大，造成溶解不好或水解不完全；称样量过小，吸光度过小，超出仪器最佳范围，易造成测定不准确误差，称量最适宜范围为30～40 mg。
2.3.3 总糖供试品溶液加酸水解时水浴加热时间考察
参照“2.2”项样品测定法，总糖供试品溶液加酸水解水浴加热时间改变，其它条件不变情况下，观察对总糖含量测定的影响。结果表明，总糖供试品溶液制备过程中，加盐酸溶液(1→2)，在水浴中水解时间长短对测定有影响。时间过短水解不完全，时间过长则检出含量下降，拟选择10 min为宜。
转贴于2.4 工作曲线的制备
精密量取对照品稀溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置25 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。精密量取以上系列对照品溶液各2 mL，分别置10 mL量瓶中，各加入DNS试液1.5 mL，摇匀，置沸水浴中加热5 min，取出，立即放入冰水中，冷却30 min，加水至刻度；以相应的溶液为空白，照分光光度法[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录VB]，在520 nm波长处测定吸收度。以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程：A＝5.678 40C－0.229 23，相关系数r＝0.999 2，说明在浓度46.6～233.0 mg/L范围内线性关系良好。
2.5 精密度试验
取还原糖供试品溶液2 mL，依法重复测定6次。结果吸收度值分别为0.249 77、0.249 94、0.250 03、0.249 89、0.250 17、0.250 21，平均为0.250 0，RSD＝0.068%(n＝6)，说明仪器性能良好，操作是精确的。
取总糖供试品溶液2 mL，依法重复测定6次。结果吸收度值分别为0.552 87、0.553 12、0.552 96、0.554 37、0.554 55、0.554 66，平均为0.553 8，RSD＝0.15%(n＝6)，说明仪器性能良好，操作是精确的。
2.6 稳定性试验
取还原糖供试品溶液2 mL，按样品测定项下依法测定，间隔一定时间测定1次，共测0～4 h，测得吸收度值分别为0.249 77、0.251 10、0.249 53、0.248 06、0.246 35、0.241 70、0.236 91，平均为0.246 20，RSD＝2.08%(n＝7)，说明还原糖供试品溶液在4 h内是稳定的。
取总糖供试品溶液2 mL，按上法测定，测得吸收度值分别为0.552 87、0.571 17、0.573 49、0.575 59、0.565 75、0.575 12、0.578 70，平均为0.570 38，RSD＝1.53%(n＝7)，说明总糖供试品溶液在4 h内是稳定的。
2.7 重复性试验
取同一批号样品5份，按还原糖供试品溶液制备方法制备，依法测定，计算还原糖含量分别为5.801%、6.048%、6.123%、6.003%、6.207%，还原糖平均含量为6.04%，RSD＝2.53%(n＝5)，说明本方法重复性好。
取同一批号样品5份，按总糖供试品溶液制备，依法测定，计算总糖含量分别为19.453%、20.588%、19.665%、19.830%、19.318%，总糖平均含量为19.77%，RSD＝2.51%(n＝5)，说明本方法重复性好。
2.8 回收率试验
2.8.1 还原糖
分别精密称取同一批样品约17 mg，5份，各精密加入1.033 2 mg/mL的对照品溶液1.0 mL，同时称取2份样品(每份约35 mg)随行对照测定其含量。按测定法进行测定，结果见表1。随行样品测得还原糖含量平均值为6.03%。结果显示，平均回收率为99.0%，RSD＝3.52%。说明本方法可行。表1 还原糖加样回收试验（略）
2.8.2 总糖
分别精密称取同一批样品约17 mg，5份，各精密加入1.033 2 mg/mL的对照品溶液3.5 mL，同时称取2份样品(每份约35 mg)随行测定其含量。按测定法进行测定，结果见表2。随行样品测得总糖含量平均值为19.77%。结果显示，平均回收率为102.1%，RSD＝3.53%。说明本方法可行。表2 总糖加样回收试验（略）
2.9 3批样品含量测定
(见表3)表3 3批药材总多糖测定结果（略）经3批样品含量测定结果表明，红毛五加药材中总多糖含量为1.3～1.9 mg/g。
3 讨论
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。单糖都是还原糖，对于多糖可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖含量(还原糖以葡萄糖含量计)，以总糖含量减去还原糖含量，即为总多糖的含量。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，DNS则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质的颜色深浅成正比，利用分光光度计，在520 nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一个水分子，所以在计算总多糖含量时应乘以0.9。
本试验运用DNS法测定样品中还原糖和总糖的含量，可计算出样品中具有生物活性的总多糖的含量。而通常运用的苯酚-硫酸法及蒽酮法均是测定总糖含量，因方法局限性无法用该方法测定还原糖(单糖)的含量，则不能明确表明其中多糖的含量，因此，DNS法可同时方便地测还原糖和总糖的含量，具有独到的实用性。在本试验多糖的分离与提取中，选用70%乙醇浓度进行醇洗步骤，是通过DNS法对不同乙醇浓度(40%、60%、70%、80%)提取总糖及还原糖的收得率的比较，计算出总糖的多寡，权衡做出适宜的选择。
本试验条件选择中，样品称样量的大小以及总糖水解时加热时间长短至关重要，称样量一般宜30～40 mg。总糖供试液制备过程中加盐酸溶液(1→2)，水浴中水解时间长短对含量测定有影响，水解时间过短(3～5 min)则可能水解不完全，时间过长(大于20 min)则检出总糖含量下降，并随时间加长下降加速，其原因是单糖进一步水解为5-羟甲基糠醛，不能与DNS缩合成有色物质，再者可能水解后的单糖再发生聚合所致总糖含量有明显下降趋势。因此，本试验水解时间需严格控制，否则会影响测定结果的准确性。
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