肉苁蓉抗运动性疲劳机制的实验分析

【摘要】 ：目的 观察肉苁蓉对负重游泳小鼠肝脏乳酸脱氢酶同工酶、糖原及一氧化氮合酶3(NOS3)的影响，探讨其抗运动性疲劳的作用机制。方法 将昆明种小鼠随机分为正常对照组、运动对照组和肉苁蓉实验组。正常对照组和运动对照组每只每日灌胃生理盐水0.2 mL，肉苁蓉实验组每只每日灌胃肉苁蓉水煎液0.2 mL(3 g/kg)，共15 d；末次给药1 h后，运动对照组和肉苁蓉实验组小鼠尾部负重5%游泳90 min，10 h后连同正常对照组小鼠处死取肝脏，一部分用中性甲醛固定制备石蜡切片，一部分制成肝细胞匀浆检测乳酸脱氢酶活性；常规HE染色观察肝脏组织结构，糖原染色法显示肝脏糖原，S-P免疫组织化学染色法检测小鼠肝脏NOS3的表达。结果 运动对照组与正常对照组比较，乳酸脱氢酶活性高(P&<0.05)，肝脏结构损伤严重，糖原含量减少，NOS3表达下降(P&<0.05)；肉苁蓉实验组与运动对照组比较，乳酸脱氢酶活性降低，主要是乳酸脱氢酶5(LDH5)下降，肝小叶结构较清晰，糖原丰富，NOS3表达上调(P&<0.05)。结论 肉苁蓉可降低LDH5活性，上调NOS3的表达，促进肝糖原合成，发挥肝脏保护和促进体能恢复作用。

【关键词】 肉苁蓉　肝糖元　一氧化氮合酶3　小鼠

　 Abstract：Objective To study the effect of cistanche deserticola on lactate dehydrogenase (LDH) isoenzyme， glycogen and nitric oxide synthase 3 (NOS3) of liver in the mice burden swimming and explore relevant molecular mechanisms of anti-sports fatigue. Methods The mice were devided into the normal control group， the sport control group and the cistanche deserticola experimental group. Each mice of the normal control group and the sport control group was given saline 0.2 mL per day. Each mice of the cistanche deserticola experimental group was given water decoction of cistanche deserticola 0.2 mL (3 g/kg) per day. The administrations were for 15 days. The burden swimming for 90 minutes was carried out on the mice of the sport control group and the cistanche deserticola experimental group at 1 hour after the last administration. Livers of the mice were removed after 10 hours of swimming. One part of liver was fixed in the neutral formalin liquid to prepare the paraffin sections and the others was used for measurement of LDH activity. The structure of the liver was observed by staining of HE and the liver glycogen were measured by staining of glycogen. NOS3 was examined by S-P immunohistochemical method. Results The liver structure of the sport control group was injured seriously， the isoenzyme of LDH4 and LDH5 were higher， the liver glycogen were poor， NOS3 was decreased compared with the normal control group (P&<0.05). The liver structure of the cistanche deserticola experimental group was good， LDH5 isoenzyme was low， the glycogen was rich and expression of NOS3 was upregulated compared with the sport control group (P&<0.05). Conclusions Cistanche deserticola could decrease LDH5， protect the liver of the mice burden swimming and accelerate glycogen accumulation by increasing expression of NOS3 to protect liver and improving physical capacity recovery.

　　Key words：cistanche deserticola；liver glycogen；nitric oxide synthase 3；mice

　　　肉苁蓉，又名大芸，为列当科二年寄生草本植物，干燥带鳞叶的肉质茎，主产于内蒙古、甘肃、新疆、青海等地的沙质土壤和半沙质的草原地带，在众产地中以内蒙肉苁蓉质量最佳。肉苁蓉性味甘、咸、温，入肾、大肠经，主要功用是补肾壮阳、益精血、润肠通便，常用于治疗阳痿、不孕、腰膝酸软、筋骨无力、肠燥便秘等病症。本研究旨在通过小鼠负重游泳试验，观察肉苁蓉对负重游泳小鼠肝脏乳酸脱氢酶(LDH)、肝脏糖原和一氧化氮合酶3(NOS3)的影响，探讨其对肝脏的保护机制，为肉苁蓉在运动保健食品方面的深入研究和开发利用提供理论依据。

　　1 实验材料

　　1.1 动物

　 30只雄性昆明鼠，清洁级，体重(20±0.5)g，内蒙古大学动物中心提供。

　　1.2 药物

　 肉苁蓉(Cistanche deserticola Y.C.Ma)产于内蒙古额吉纳旗并已鉴定。按原药材∶水＝100 g∶400 mL，先浸泡30 min，加热煮沸后再用温火煎30 min，将药液倒出，按100 g∶200 mL比例重煎。将两次的煎液混合在一起用两层纱布过滤，然后浓缩至相当于每毫升含原药材1 g的水煎液原液，4 ℃冰箱保存。

　　1.3 试剂和仪器
　　
　　NOS3多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。S-P试剂盒购自福建迈新试剂公司。乳酸脱氢酶同工酶试剂盒购自内蒙同日试剂公司(日产独资)。南京JD-80彩色图像分析仪。美国UVP凝胶图像分析系统。

　　2 实验方法

　　2.1 分组与给药
　　
　　昆明种小鼠随机分为正常对照组、运动对照组、肉苁蓉实验组，每组10只。正常对照组和运动对照组灌胃生理盐水，每日1次，0.2 mL/次；肉苁蓉实验组灌胃肉苁蓉水煎液(取水煎液原液3 mL加水至10 mL)，每日1次，0.2 mL/次，日用量为3 g/kg，连续给药15 d。末次给药1 h后将运动对照组、肉苁蓉实验组小鼠尾部负重1 g铅坠，放入高50 cm、长50 cm、宽35 cm的水池中游泳，温度保持在(30±0.5)℃，不停观察小鼠，若发现小鼠停止游泳用木棍拨拉刺激其运动，持续90 min。运动后正常饮食，休息10 h后连同正常对照组小鼠用脱颈法处死小鼠，取出肝脏，一部分用10%中性甲醛固定，经脱水、透明、浸蜡、包埋制成4 μm厚的连续切片，采用HE染色法观察各组肝脏组织结构；另一部分用生理盐水冲洗后，-20 ℃冷冻保存，测定时室温解冻，用滤纸吸干后称重，再用生理盐水制备肝脏匀浆，3 500 r/min离心15 min，取上清液用电泳法测乳酸脱氢酶同工酶活性。

　　2.2 乳酸脱氢酶活性的测定

　 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，根据LDH各同工酶电泳迁移率的差异将它们分离开来。样品的分离胶浓度为7%，pH 8.9，浓缩胶浓度为4%，pH 6.8。10 μL样品与1滴甘油及溴酚蓝指示剂混合加样。电极缓冲液为Tris-甘氨酸(pH 8.7)，开始稳压100～150 V，30 min后加到200～250 V，电泳4 h。电泳后采用乳酸脱氢酶同工酶试剂盒染色，37 ℃染色30 min，呈现出蓝色的乳酸脱氢酶同工酶谱带，然后用清水漂洗，冰醋酸固定，用UVP凝胶图像分析系统进行数据分析。

　　2.3 糖原染色

　 4 μm厚的连续切片常规脱蜡至水，入1%过碘酸液37 ℃15 min，流水冲洗后入Schiff液作用60 min，流水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察染色结果。

　　2.4 免疫组织化学染色
　　
　　切片常规脱蜡至水，以柠檬酸缓冲液微波修复抗原，用A液作用10 min，除去内源性过氧化物酶，以B液(稀释的山羊血清)封闭10 min，加入一抗在湿盒中4 ℃过夜，第2天用pH 7.4的PBS液洗涤5 min×3次，后加生物素标记的C液(二抗工作液)孵育10 min，PBS液洗涤5 min×3次，再加辣根过氧化物酶标记的D液孵育10 min，PBS液洗涤5 min×3次，最后在DAB溶液中显色5 min，自来水冲洗，HE复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。封片后在光镜下观察。每批实验均以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。

　　2.5 一氧化氮合酶3表达的分析

　 在光镜下以目测半定量法初步观察，NOS3阳性产物呈深棕黄色或棕黄色，阳性产物定位于肝细胞的胞浆内或肝细胞间的内皮细胞的胞浆内，蓝色背景为阴性。然后采用彩色图像分析系统，测量阳性反应物的灰度值，在40倍物镜下每张片子随机测量4个视野的参数取其平均值，用此参数反映NOS3染色强度的变化。

　　2.6 统计学方法

　 所有数据以x±s表示，采用SPSS11.0统计软件包进行t检验，以P&<0.05为差异有显著性意义。

　　3 结果

　　3.1 光镜观察组织结构

　 正常对照组肝小叶结构清晰，细胞索排列整齐，肝窦正常，肝细胞无明显病变，核结构清晰。运动对照组正常组织结构消失，小叶界限不清，细胞索紊乱，大部分肝窦消失，肝细胞广泛性空泡变性，表现为细胞体积增大，胞浆疏松、浅染，乃至清亮、透明，部分肝细胞呈典型的气球样变，可见少量灶性或点状坏死。肉苁蓉实验组肝细胞呈轻度浊肿，但排列规整，细胞内无明显空泡及疏松，细胞索排列较整齐，细胞核结构较清晰。

　　3.2 对负荷运动小鼠肝乳酸脱氢酶同工酶活性的影响

　　(见表1)表1 肉苁蓉对负荷小鼠肝脏乳酸脱氢酶同工酶的影响(略)注：与正常对照组比较，*P&<0.05；与运动对照组比较，#P&<0.05(下同)

　　3.3 光镜观察肝糖原染色

　 正常对照组糖原含量虽不高，但各肝细胞中均有糖原存在，分布均匀，无空泡现象；运动对照组糖原较少，散在分布于肝细胞，部分区域出现空泡现象；肉苁蓉实验组糖原丰富，但在细胞的一侧聚集很多。

　　3.4 光镜观察一氧化氮合酶3的表达及图像定量分析
　　
　　正常对照组肝细胞的细胞质中有强阳性表达呈弥散状分布，尤其在双核细胞中有强阳性表达，内皮细胞有阳性表达。运动对照组肝细胞和内皮细胞的细胞质中表达均减弱。肉苁蓉实验组肝细胞的细胞质有阳性表达，内皮细胞中有强阳性表达。彩色图像分析仪分析结果见表2。表2 NOS3在肝细胞和内皮细胞内表达差异的比较(略)

　　4 讨论
　　
　　人体运动需要能量，机体在新陈代谢过程中同样也需要能量。细胞代谢直接利用能源来自于三磷酸腺苷(adenosine triphospate，ATP)的分解产生，ATP的合成需要的能量最终主要由糖的分解代谢提供。
　　
　　研究表明，机体剧烈运动后，会产生大量H+、自由基、乳酸等影响细胞正常代谢的物质，同时由于细胞内葡萄糖的匮乏导致机体发生运动性疲劳和细胞损害。本研究结果显示，大量运动后肝脏组织结构损害非常严重，同时也影响到细胞的合成代谢，如肝糖原合成减少。服用肉苁蓉的小鼠在大量运动后可观察到肝脏损害减轻，以LDH5减少为主，且肝糖原含量显著多于运动对照组，提示肉苁蓉可能通过减少LDH5达到肝脏保护作用、维持机体正常的生理机能。从糖原染色结果看，肉苁蓉实验组糖原含量比正常对照组含量还高，肉苁蓉是在运动前就增加了肝脏糖原储备还是在运动后应激状态下加速糖原合成，由于在实验中没有设计不运动肉苁蓉的对照组而无法下结论，还有待于下一步证实，但肉苁蓉在大量运动后对肝脏的保护作用和促进糖原合成作用是显而易见的。
　　
　　NO是近几年被运动界高度重视的一个小分子物质，NOS是NO生成的主要限速因子，目前已经确认NOS有3种类型的同工酶，NOS1被称为神经元型一氧化氮合酶，它存在于神经元细胞、骨骼肌细胞等，主要参与神经发育、神经分泌、学习和记忆过程；NOS2为诱导型一氧化氮合酶，主要存在于平滑肌细胞、巨噬细胞、淋巴细胞中，此酶一旦诱生，可持续合成NO，直至底物耗尽或细胞死亡，目前认为参与细胞损伤[1]；NOS3为内皮型一氧化氮合酶，主要分布于内皮细胞、肝细胞，生成的NO主要参与生理功能。本研究结果表明，大量运动后内皮细胞和肝细胞NOS3表达减弱，由此产生的NO减少，使血管不能有效扩张，血流量减少，合成糖原的原料不能运输到肝细胞，故糖原合成减少；肉苁蓉可上调内皮细胞和肝细胞NOS3的表达，反应性扩张血管，增加血流量，加快运输糖原合成原料的能力，加速糖原合成，维持机体处于正常生理代谢水平。故通过降低LDH5来保护肝脏、上调NOS3的表达来促进乳酸的糖异生过程可能是肉苁蓉保护肝脏和促进体能恢复的重要作用机制。本项研究为肉苁蓉在运动医学领域的进一步开发利用提供了科学实验依据，亦为肉苁蓉效应物质的开发和提纯打下基础。

参考文献