作者：辛晓明，王浩，冯蕾，朱玉云，高允生
【摘要】 目的 研究杜仲总多糖对环磷酰胺致免疫低下小鼠的影响。方法 应用环磷酰胺建立免疫低下小鼠模型，给予不同剂量杜仲总多糖后，测定小鼠体重、胸腺指数、脾指数、腹腔巨噬细胞吞噬率、吞噬指数等指标。结果 300 g杜仲原药材经提取分离得9.3 g多糖干品。应用环磷酰胺后，小鼠体重、胸腺指数、腹腔巨噬细胞吞噬率、吞噬指数均降低。杜仲总多糖能减轻环磷酰胺致小鼠体重的下降，升高免疫低下小鼠胸腺指数，明显增加小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率、吞噬指数(P&<0.01)。与空白组比较，杜仲总多糖还能提高正常小鼠的脾指数(P&<0.05)。结论 杜仲总多糖能够较好地增强小鼠免疫功能。
【关键词】 杜仲总多糖；环磷酰胺；免疫调节；小鼠
Abstract：Objective To study the immunoregulatory activity of eucommia ulmoides oliv polysaccharides (EOP) on immunodepressive mice. Method The immunodepressive mice model was established with cyclophosphamide (CY) treated. EOP was given with different doses， and mouse weight， thymus index， spleen index， abdominal cavity macrophage engulfing rates， engulfing index were measured. Result 300 grams Eucommia ulmoides Oliv crude drugs after withdraw separate gained 9.3 grams polysaccharides. After CY injection， the mouse weight， chest gland index， abdominal cavity macrophage swallowing rate， phagocytic count reduced. EOP could resist the mouse body weight drop induced by CY， elevate the thymus index of immunity low mouse， obviously increase mouse abdominal cavity macrophage engulfing rates and engulfing index (P&<0.01). And compared with the blank group， Eop could promote the spleen weight of immunity low mouse (P&<0.05). Conclusion EOP could enhance immunofunction of immunodepressive mice.
Key words：eucommia ulmoides oliv polysaccharides；cyclophasphamide；immunoregulotory activity；mice
杜仲总多糖(Eucommia ulmoides Oliv Polysaccharides，EOP)是从杜仲的干燥树皮中提取出的水溶性成分，是近年来发现的杜仲又一活性成分。本实验观察杜仲总多糖对传统化疗药物环磷酰胺致免疫抑制小鼠的影响，并初步探讨其作用机制，为杜仲的进一步开发利用提供实验依据。
1 实验材料
1.1 动物
昆明种清洁级8周龄小白鼠60只，体重(21±4)g，雌雄各半，泰山医学院实验动物中心提供，合格证号：鲁动质字20103；标准饲料喂养，实验前饲养5 d。
1.2 药物与试剂
杜仲中药饮片，由本院中药学教研室高红莉老师鉴定为正品；环磷酰胺粉针剂，上海华联制药有限公司生产，批号041109(用时以生理盐水配成2 mg/mL溶液)；香菇多糖冻干粉，福建梅峰制药厂生产，批号041223(用时以生理盐水配成0.5 mg/mL溶液)。鸡血红细胞混悬液，用时取新鲜鸡血5 mL，离心去上清液，用生理盐水洗涤2次，再以生理盐水配成1%混悬液。
1.3 仪器
中草药粉碎机，FW/T型，天津市泰斯特仪器有限公司；RE-52A型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；SHB-1395A型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；SPectrumLab54紫外可见分光光度计，上海棱光技术有限公司；电子分析天平，AR2140，奥豪斯(上海)公司；OlymPus cx21型显微镜，广州市科迅实验器材有限公司。
2 实验方法
2.1 杜仲总多糖的提取、分离[1]
取杜仲皮300 g，粉碎，用4倍体积的95%乙醇回流4 h，冷却过滤，滤渣晾干即为提取多糖的预处理材料。在预处理材料中加入8倍体积的蒸馏水于80 ℃水浴中提取2 h，过滤，滤渣继续用8倍体积的蒸馏水于80 ℃水浴中提取2 h，如此重复2次，合并3次滤液，滤液于70 ℃浓缩至原体积的1/10，得粗提液。取粗提液加入1/5倍体积的氯仿和1/25倍体积的正丁醇，振荡10 min，在4 000 r/min下离心10 min，分离，水相再如此重复3次，得最终水相溶液。水相溶液用4倍体积的95%乙醇醇沉，静置过夜，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤沉淀，烘干称重，即得提取物结晶品。
采用硫酸-苯酚法鉴定[2-3]，即取提取粗品4.2 mg，加温热水配成100 mL，即相当42 μg/mL，取2 mL，然后加入5 mL 5%的苯酚溶液，再加入7.5 mL浓硫酸，以蒸馏水代杜仲提取粗品做空白对照，观察颜色变化。
2.2 分组及给药
取健康小白鼠60只，体重(22±3)g，雌雄各半，随机分为6组(每组10只)：空白对照组、环磷酰胺组、阳性药香菇多糖组(10 mg/kg)及杜仲总多糖高、中、低剂量组(200、100、50 mg/kg)。除空白对照组外，余动物第1、3、5、7天均腹腔注射环磷酰胺40 mg/kg[4]，第9天时腹腔注射6%可溶性淀粉溶液1 mL/只；第11天时腹腔注射1%鸡血红细胞混悬液1 mL/只。杜仲总多糖高、中、低剂量组及香菇多糖组按指定剂量灌胃给药，空白对照组和模型组给予等量生理盐水。
2.3 观察指标
2.3.1 体重
自给药第1天起隔日测量小鼠体重1次，并记录数据。
2.3.2 胸腺指数、脾指数
解剖取胸腺、脾脏，用电子分析天平精密称量胸腺、脾脏的质量。按下式计算胸腺指数、脾指数。
胸腺指数＝胸腺质量(mg)/小鼠体重(g)
脾指数＝脾脏质量(mg)/小鼠体重(g)
2.3.3 吞噬率和吞噬指数
给予鸡血红细胞混悬液半小时后，取腹腔液涂片，经瑞士染色、冲洗、晾干后，在高倍油镜下观察，计算100个巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数，公式如下。
吞噬率＝吞噬鸡血红细胞的巨噬细胞数/100个巨噬细胞×100%
吞噬指数＝被吞噬鸡血红细胞总数/吞噬鸡血红细胞的巨噬细胞数×100%
2.4 统计学方法
应用SPSS10.0软件中相应程序对数据进行统计学处理，2组间均数采用t检验。
3 结果
3.1 多糖的提取与鉴定结果
杜仲原药材300 g经提取烘干后得杜仲提取物9.3 g。杜仲提取物呈咖啡色结晶，不易吸湿，易溶于热水。经硫酸-苯酚反应后提取物水溶液呈浅橙色，颜色比反应前加深；空白对照液呈淡黄色。由此实验说明提取物可定性为杜仲总多糖。
3.2 各项指标检测结果
(见表1～表3)表1 对环磷酰胺致免疫低下小鼠体重的影响(略)注：与空白对照组比较，*P&<0.05，**P&<0.01；与环磷酰胺组比较，#P&<0.05，##P&<0.01(下同)。表2 对环磷酰胺致免疫低下小鼠胸腺指数、脾指数的影响(略)表3 对环磷酰胺致免疫低下小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响(略)
4 讨论
杜仲是常用滋补药材之一，其入药已有两千多年的历史。国内外学者对杜仲化学成分进行了大量研究，目前认为其主要活性成分有木质素类、环烯醚萜类、有机酸、萜类、多糖、氨基酸和杜仲胶等。本次实验以环磷酰胺40 mg/kg复制出免疫抑制模型。实验结果表明，杜仲总多糖能减轻环磷酰胺所致小鼠体重的下降，升高免疫低下小鼠的胸腺指数，明显增加小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率、吞噬指数(P&<0.01)。与空白对照组比较，杜仲总多糖还能提高正常小鼠的脾指数(P&<0.05)。由此说明，杜仲总多糖具有一定的非特异性免疫增强功能。
【参考文献】
[1] Suzuki I.Immunomodulation by Microbial.Products and related Synthetic Compounds[M].Amsterdam：Excepta Medica，1981.347－349.
[2] 赵 莉，阮期平.山茱萸多糖的研究初报[J].锦阳师范高等专科学校学报，2001，20(5)：48－50.
[3] 程 霜，崔庆新，王 勇.水溶性苦瓜多糖的提取与测定[J].郑州粮食学院学报，2000，21(2)：53－55.
[4] 高 竼，钱嘉林，刘长喜，等.环磷酰胺对小鼠免疫抑制的动物模型建立[J].环境与职业医学，2004，21(4)：314－318.