作者：丁德光，李昊，孙国杰，王亚文，宋爱群
【摘要】 目的 通过观察电针对脑缺血再灌注大鼠缺血区皮质神经细胞凋亡和NF-κB蛋白表达的影响，研究电针对缺血性脑损伤的保护机制。方法 采用大脑中动脉线栓法制作模型，电针大鼠的水沟、内关，运用TUNEL法观察各组大鼠皮质神经细胞凋亡，免疫组化法观察各组大鼠缺血区皮质NF-κB蛋白表达。结果 电针组缺血皮质中神经细胞凋亡和NF-κB蛋白表达与模型组相比均降低。结论 电针通过抑制NF-κB蛋白表达减少神经细胞凋亡来对抗缺血再灌注脑组织神经损伤。
【关键词】 脑缺血再灌注；电针；NF-κB；大鼠
Abstract：Objective To observe the effect of electroacupuncture (EA) on the expression of NF-κB in cerebral ischemia area of cerebral ischemia-reperfusion rats and the neuron apoptosis in cortex by EA on shuigou and neiguan (left) point， and study the protective effect and its mechanism of EA on the cerebral ischemia. Method Cerebral ischemia reperfusion model was established by occlusion of the middle cerebral artery for 30 min and then removal， then EA shuigou and neiguan left points of experimental rats. Neuronal apoptosis in cortex was observed by the terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL)， NF-κB protein in the ischemia cortex was detected by immunohistochemistry. Result The neuronal apoptosis and the expression of NF-κB protein in the ischemia cortex was deteded of ischemia side of EA treatment groups were lower comparing with model group. Conclusion EA can lighten the neurons injury after cerebral ischemia-reperfusion by decreasing the expression of NF-κB protein and the neuronal apoptosis in the ischemia cortex.
Key words：cerebral ischemia-reperfusion；electroacupuncture；NF-κB；rat
NF-κB(nuclear factor-kappa B)是一种核转录因子，具有传递细胞核内外信息的功能，在免疫应激反应、炎症和细胞凋亡等方面具有重要的作用，中枢神经系统发生某些病理改变时，可表现特异的活化。既往的研究证实，NF-κB参与了脑缺血再灌注损伤的过程[1]，并在缺血性损伤导致的神经细胞凋亡中起着重要的作用[2]。本实验即是通过观察模型组及治疗组大鼠神经细胞凋亡和皮质神经细胞NF-κB核反应阳性细胞数的变化，来研究电针抗脑缺血再灌注大鼠脑组织损伤的机制。
1 材料和方法
1.1 主要试剂及仪器
原位细胞凋亡检测TUNEL试剂盒、兔抗大鼠NF-κB-P65单克隆抗体、羊抗兔SABC试剂盒、DAB显色试剂，北京中山生物科技有限公司产品；4%多聚甲醛，武汉天源生物科技有限公司产品。HPIAS-1000计算机高清晰彩色图像分析仪，华中科技大学同济医学院千屏影像公司生产；石蜡切片机，Leica RM 2015，德国产；恒温培养仪(PYX-DHS-40，上海跃进医疗器械厂)。
1.2 动物分组及模型制备
健康成年清洁级SD大鼠，雌雄各半，共84只(华中科技大学同济医学院实验动物中心提供)，体重180～220 g。随机分为空白对照组6只，假手术组、模型组、电针组各18只(每组分为手术后12、24、72 h共3时段，每时段6只)，另24只备用。模型采用Zea-longa方法并稍加改进[3]，栓线插入途径：颈外动脉→颈总动脉→颈内动脉→大脑中动脉(均为右侧)，深度约17 mm，30 min后，抽取栓线再灌注，在手术结束麻醉清醒后，观察神经症状，按照Bedcrson神经缺损体征评分标准[4]，选择符合一级以上者为实验观察对象。
1.3 针刺治疗及模型处理
空白对照组：不作任何处理，直接取标本。模型组：造模成功后按要求喂养。电针组：于造模麻醉清醒后电针治疗1次，其中12 h组于取材前再电针治疗1次，24、72 h组每12 h电针治疗1次。按照文献[5]方法取水沟、内关，水沟与左侧内关接上海产G6805治疗仪，连续波，频率2 Hz，强度约为1.5 mA，右侧内关留针，时间持续30 min。假手术组：除不插入线栓外，其余手术步骤同模型组。于造模完毕后12、24、72 h分别取材。
1.4 标本的采集和制备
各组大鼠按照上述造模方法进行相应处理后以0.9%水合氯醛足量麻醉，先后以30 ℃生理盐水和4%多聚甲醛灌注后，断头取脑，在视交叉前后约2 mm将脑冠状切开，留取中间部分，置于4 ℃ 4%多聚甲醛固定液(不超过24 h)；将固定后的脑组织石蜡包埋，石蜡切片机连续冠状切片，片厚4 μm，每隔10张切1张，在温水中充分展开，贴片。每分组织取6张备用。
1.5 原位细胞凋亡检测
①切片脱蜡至水。②将波片置入抗原修复盒内，加0.1 mol/L pH为7的枸橼酸缓冲液，使用750 W(高)微波辐射1 min，加入重蒸水冷却后将玻片移到PBS(20～25 ℃)缓冲液中。③将玻片浸入0.1 mol/L TBS，室温30 min后PBS洗。④将适量TUNEL反应混合物加在切片上，湿盒内37 ℃孵育60 min后PBS洗。⑤0.3% h3O2室温10 min，重复第③道工序。⑥加入适量的POD转换剂，湿盒，37 ℃孵育30 min后PBS洗。⑦DAB显色。⑧酒精脱水、二甲苯透明、中性树脂封片。
1.6 NF-κB-P65免疫组化染色
①石蜡切片常规脱蜡、入水。②流水及 3% h3O2水各冲洗30 s，0.01 mol/L PBS冲洗5 min×3次；滴加1滴4% BSA，湿盒中37 ℃孵育10 min。③滴加1滴一抗，湿盒中37 ℃孵育120 min， PBS冲洗5 min×3次。④滴加一滴标记有NF-κB 的二抗，湿盒中37 ℃孵育120 min，PBS冲洗5 min×3次。⑤滴加1滴SABC，湿盒中37 ℃孵育40 min，PBS冲洗5 min×3次。⑥加DAB显色剂5 min；苏木素复染。⑦盐酸酒精分色、酒精上行脱水、二甲苯透明、封片。
1.7 图像分析
采用HPIAS-1000计算机高清晰彩色图像分析仪，在400高倍镜视野下，对实验各组片缺血皮质区随机取10个非重叠的视野进行观察。神经细胞凋亡率：记阳性细胞数(镜下观察呈棕黄色的圆形或卵圆形致密块状)和阴性细胞数，并计算凋亡细胞百分率[凋亡细胞百分率＝阳性细胞数/(阳性细胞数＋阴性细胞数)]；NF-κB-P65阳性细胞数：以核染色阳性的单个神经细胞为1个阳性标记(镜下观察细胞核染成棕黄色或有棕黄色颗粒沉积)，各组片NF-κB-P65反应阳性的神经细胞记数(单位：个/摄取视野)。
1.8 统计学方法
所有数据以x±s表示，所有数据输入计算机，以SPSS13.0软件统计包处理。
2 结果
(见表1、表2)表1 各组大鼠大脑皮质凋亡神经细胞阳性率(平均凋亡率)比较(略)注：与假手术组比较，▲P&<0.01；与模型组比较，☆P&<0.05，☆☆P&<0.01(下同)。表2 各组大鼠皮质NF-κB核反应阳性细胞数比较(略)
3 讨论
细胞凋亡(apoptosis)是在生理或病理条件下的一种主动死亡方式，是受细胞内基因及细胞外一些因子调控的生物学过程。在生理条件下它可调节机体发育，维持机体内环境的稳定；同时它参与各种病理过程，如自身免疫性疾病、脑缺血再灌注损伤及衰老过程等。1990年Shigeno等[7]报道了在短暂性脑缺血后使用蛋白合成阻滞剂亚环己酮能抑制迟发性神经细胞死亡的发生，首先提出了缺血性神经细胞坏死与凋亡有关。目前已证实在缺血性损伤中有细胞凋亡的存在，尤其在再灌注损伤中起重要作用，抑制细胞凋亡可以减轻脑缺血损伤的程度。
许多研究表明，在缺血状态下，大脑神经元、胶质细胞和脑血管内皮细胞中的NF-κB被激活，而NF-κB的激活可促使粘附分子、细胞因子的表达。Irving等[8]观察了大鼠永久性局灶性脑缺血后不同时间点NF-κB的活性。在大脑中动脉闭塞(MCAO)3 h后，通过免疫组化和Western印迹法检测到NF-κB的核转位，同时应用EMSA检测到NF-κB结合活性升高。高氏等[1]运用原位杂交法检测大鼠脑缺血再灌注后皮质及纹状体NF-κB-P65 mRNA的表达于缺血再灌注后2 h～3 d明显升高。本研究显示，脑缺血再灌注12 h组可见较多的神经凋亡细胞，24、72 h后缺血侧大鼠皮质中均可见大量凋亡细胞，而NF-κB蛋白表达与神经凋亡细胞时间变化规律基本相同，说明了脑缺血再灌注损伤后的神经细胞凋亡与NF-κB-P65蛋白表达有密切关系。
本研究结果显示，模型组大鼠缺血后脑组织皮层神经元NF-κB-P65核反应阳性细胞表达较正常组及假手术组明显增加，在12 h组NF-κB核反应阳性细胞的表达即增加，在24 h核反应阳性细胞数明显升高，72 h亦保持较高的水平。电针治疗后各时段大鼠缺血侧皮质区也见较多NF-κB核反应阳性细胞表达，与模型组相比，NF-κB核反应阳性细胞表达的量明显减少；同时电针治疗后大脑皮质缺血区神经细胞凋亡率也明显下降。提示电针抗缺血性脑损伤的机制之一可能是通过减少NF-κB核反应的激活，抑制NF-κB-P65的活性，来减少缺血区皮质神经元凋亡的。
【参考文献
】
[1] 高晓玉，孙兆林，杨学伟，等.大鼠脑缺血再灌注后NF-κB P65mRNA的表达及其与细胞凋亡的关系[J].齐鲁医学杂志，2004，19(1)：17－19.
[2] Howard EF，Chen Q，Cheng C，et al.NF-kappa B is activated and ICAM-1 gene expression is upregulated during reoxygenation of human brain endothelial cells[J].Neurosci Lett，1998，248(3)：199.
[3] 徐克前.分子生物学检测技术实验指导[M].北京：人民卫生出版社， 2003.24.
[4] Barone FC， Arvin B， White RF，et al.Tumor necrosis factor-alpha： amediator of focal ischemic brain injury[J].Stroke，1997，28(6)：1233－1244.
[5] Toulmond S，Parne P，Linthorst AE.When cytokines get on your nerve：cytokine networks and CNS pathologies[J].Trends Neurosci，1996，19(10)：409.
[6] Shigeno T，Yamaski Y，Kato G，et al.Reduction of delayed neuronal death by inhibition protein synthesis[J].Neurosci Lett，1990，120：117.
[7] Irving EA， Hadingharm SJ， Robert J， et al. Decreased nuclear factor-κB DNA binding activity following permanent focal cerebral ischemia in the rat[J].Neurosci Lett，2000，288：45－48.