【摘要】 目的 研究丹赤胶囊对子宫内膜异位症患者体外培养细胞上清液中单核细胞趋化因子-1(MCP-1)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和可溶性细胞间粘附分子-1(sICAM-1)的水平及细胞活性的影响。方法 实验分为丹赤大、中、小剂量组及空白对照组、丹那唑对照组。采用ELISA法和MTT法，观察异位内膜细胞培养上清液中MCP-1、TNF-α和sICAM-1的水平及细胞活性。结果 丹赤大剂量组明显降低TNF-α的水平；丹赤大、中剂量组能明显降低MCP-1的水平。结论 丹赤胶囊通过降调参与子宫内膜的粘附种植-血管生成-浸润发展3个阶段的细胞因子的水平及活性，抑制子宫内膜细胞的粘附、种植和进一步生长。
【关键词】 子宫内膜异位症；丹赤胶囊；细胞因子
Abstract：Objective To reaserch the effect of Danchi capsule on the changes of monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) and solution intercellular adhesion molecule-1 (sICAM-1) of cell supernatant of eutopic endometrium in patients with edndometriosis. Methods Cells were pied into five groups：Danchi large， medium， small dosage group， blank group and dannazol group in control， detected by ELISA method and MTT method. To observe the levels of MCP-1， TNF-αand sICAM-1 of eutopic endometrial cells and cell activity. Results The group of DanChi large dosage decreased significantly the level of TNF-α， the group of Danchi large and medium dosage decreased the level of MCP-1 significantly. Conclusion Danchi capsule may descend and inhibite the production and activity of these cytokines which involved in three steps： adhesion and implantation-angiogenesis-progression and infiltration， then inhibit adhesion and implantation of endometrial cells.
Key words：endometriosis；Danchi capsule；cytokine
子宫内膜异位症 (Endometriosis，EM)是生育年龄妇女的多发病、常见病，发病率一般在10%～15%，不孕患者中可高达30%～58%，其发病率呈逐年上升趋势。子宫内膜异位症的发生、发展是一个多因素参与的复杂过程，此过程主要与子宫内膜细胞的粘附种植-血管生成-浸润发展这3个阶段有关。期间涉及众多细胞因子的参与，如促粘附分子(ICAM-1)、促炎性因子(MCP-1)及肿瘤坏死因子(TNF-α)等。本实验研究通过体外培养子宫内膜异位症卵巢异位内膜细胞，观察丹赤胶囊对异位内膜细胞分泌细胞因子及细胞活性的影响，探讨丹赤胶囊治疗子宫内膜异位症的作用机理。
1 材料与方法
1.1 标本的采集
协和医院2003年7月经腹腔镜确诊为巧克力囊肿患者3例，年龄27～35岁；北京大学附属人民医院2003年7－12月经腹腔镜及开腹手术确诊卵巢巧克力囊肿10例，年龄26～41岁。所取的标本置于盛有冰DMEM/F12培养液的无菌瓶中，立即送实验室。所有患者术前3个月均未使用激素及其他药物治疗。
1.2 主要试剂及药物
人TNF-αELISA试剂盒96T(晶美生物工程有限公司产品)，人MCP-1和sICAM-1 ELISA试剂盒96T(上海森雄科技实业有限公司产品)，DMEM/F12干粉、胶原酶Ⅱ型、胰蛋白酶(1∶250，美国GiBCO公司产品)。丹赤胶囊：0.35 g/粒(江苏康缘药业股份有限公司生产)；丹那唑胶囊：200 mg/粒(江苏联环药业股份有限公司生产)。
1.3 体外细胞培养方法
1.3.1 原代培养
参照文献[1]方法并略作改进：将所获组织用DMEM/F12培养液洗涤3次，剪成约0.5～1 mm3大小的碎块，置于5 mL离心管中，加入2.5～5倍的双酶消化液(含0.1%胶原酶和0.25%胰蛋白酶溶液)，充分混匀后置于37 ℃恒温箱中消化，其间每10 min振荡摇匀1次。巧克力囊肿组织消化时间约为120 min。吸取消化后的细胞悬液，用DMEM/F12培养液洗涤细胞2次，以1 000 r/min离心10 min；弃上清液，向沉淀细胞中加入含10%胎牛血清和青链霉素的1∶1 DMEM/F12培养液，吹打成细胞悬液，过100目细胞筛网，收集细胞滤液(含单个间质细胞及葡萄串状上皮细胞)，在光学显微镜下进行细胞计数，调整细胞浓度为5×105接种于细胞培养瓶中，置37 ℃、5% CO2细胞孵育箱中培养，每隔2～3 d更换培养基1次，至细胞汇聚完成原代培养。
1.3.2 传代培养
倒置显微镜下观察，细胞长满80%瓶壁时传代。弃取培养瓶中的培养液，加入0.25%胰蛋白酶5 mL，于37 ℃温箱中消化，每5～10 min振荡摇匀1次，显微镜下观察细胞收缩变圆时，弃消化液，加入DMEM/F12培养液，用吸管将细胞自瓶壁吹打下来，用DMEM/F12培养液以1 000 r/min离心10 min漂洗细胞2次，弃上清液，向沉淀细胞中加入含10%胎牛血清及青链霉素的FD培养液，吹打成细胞悬液，显微镜下进行细胞计数，调整细胞浓度为1～2.5×105，接种于24孔细胞培养板中，置37 ℃、5% CO2细胞孵育箱中培养，每隔2～3 d更换培养基1次，至细胞汇聚。
1.4 细胞分组及给药
丹赤大剂量组：1 mL FD培养液加丹赤液150 μL/孔；丹赤中剂量组：1 mL FD培养液加丹赤液100 μL/孔；丹赤小剂量组：1 mL FD培养液加丹赤液50 μL/孔；丹那唑对照组：1 mL FD培养液加丹那唑液150 μL/孔；空白对照组：1 mL FD培养液/孔。
1.5 检测指标及方法
1.5.1 TNF-α、MCP-1及sICAM-1含量的检测
细胞近90%汇聚时，分组加药，24 h后收集细胞培养上清液，-80 ℃冻存。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清液中TNF-α、MCP-1、sICAM-1的含量。ELISA法严格按照试剂盒说明书进行。所有标本在一批内测定，批内误差&<10%。
1.5.2 细胞活性检测
细胞加药24 h后，收集细胞上清液，-80 ℃冻存。每孔加入1 mL FD培育液，再加入100 μL/孔MTT染料(5 mg/mL)，继续置于37 ℃、5% CO2细胞孵育箱中培养4 h，使MTT还原为甲；弃培养液，加入二甲基亚砜(DMSO)750 μL/孔使甲溶解，轻轻振荡混匀，充分溶解后，立即在酶联免疫检测仪490～630 nm波长测定吸光度值(OD)。
1.6 统计学方法
采用SPSS 10.0统计软件，计量资料采用方差分析。
2 结果
2.1 异位子宫内膜细胞生长情况
倒置相差显微镜下观察：异位内膜细胞一般12 h方可贴壁，细胞呈圆形；24 h后细胞平铺挺直生长，腺上皮细胞呈蝌蚪形，间质细胞多呈梭形，但仍有部分细胞呈串珠样漂浮；2 d后细胞开始密集生长；3 d后腺上皮细胞呈旋涡状成团生长，而间质细胞则类似于成纤维细胞样形态，排列密集；5 d后细胞贴满瓶壁80%；7 d后细胞贴满瓶壁。
2.2 子宫内膜细胞形态学特点
2.2.1 腺上皮细胞
倒置相差显微镜下观察：胰蛋白酶和胶原酶(双酶)消化后的子宫内膜腺上皮细胞呈葡萄串状，接种后24 h仍有部分呈串珠样漂浮，而大部分细胞已贴壁。细胞接种2～3 d后，腺上皮细胞呈旋涡状成团生长，排列紧密，细胞之间有小丝状物连接。单个腺上皮细胞呈蝌蚪状，细胞轮廓清晰，胞浆呈颗粒状，核圆而大，核仁明显。
2.2.2 间质细胞
倒置相差显微镜下观察：消化后呈单细胞圆形，24 h后大部分细胞已贴壁。间质细胞可见两种细胞形态：一种为多角形，有多个短小细胞突起，胞浆薄而透明，核圆居中，细胞排列无极性，平铺生长；一种为梭形，具有成纤维细胞样形态，胞浆丰富，核椭圆。
2.3 丹赤胶囊对异位内膜细胞培养上清液中细胞因子的影响
(见表1)表1 丹赤胶囊对巧克力囊肿异位内膜细胞培养上清液中
细胞因子水平的影响(略)注：与空白对照组比较，*P&<0.05，**P&<0.01(下同)。
2.4 丹赤胶囊对子宫内膜异位症细胞活性的影响
(见表2)表2 丹赤胶囊对巧克力囊肿异位内膜细胞活性的影响
(略)
3 讨论
研究表明，为了种植和生长，子宫内膜细胞必须在腹壁上建立细胞与细胞或细胞与细胞外基质间的相互联系。在这一阶段，具有促粘附作用的细胞因子扮演着非常重要的角色。粘附分子是介导细胞与细胞之间和细胞外基质间相互结合的表面受体，研究发现，子宫内膜间质细胞有较多的ICAM-1[2]。ICAM-1的升高可产生免疫抑制和降低NK细胞的杀细胞毒性，这有助于异位组织逃避机体免疫系统和NK细胞的杀伤，对异位组织侵入腹膜、卵巢等起促进作用[3]。子宫内膜异位症患者由于子宫内膜上皮细胞的细胞粘附分子的表达异常，从而导致子宫内膜上皮细胞的游走、播散。本实验结果表明，丹赤胶囊中、小剂量组能降低巧克力囊肿异位内膜细胞上清液中的sICAM-1水平。说明丹赤胶囊可能通过抑制这些促粘附细胞因子的分泌及活性，从而减轻子宫内膜细胞对细胞外基质的粘附作用及纤维合成，不利于子宫内膜细胞与腹膜接触、粘附，子宫内膜细胞则无法增殖和生长。
经腹腔镜下证实，典型的异位内膜病灶周围及间质均有新生的毛细血管包绕，说明血管生成是异位子宫内膜得以在盆腔种植及生长的重要因素。子宫内膜之所以能成功地异位种植、生长，与局部新生毛细血管的发生有关，血管的发生和种植可促进异位内膜的增殖和浸润入腹膜组织内，形成盆腔的异位灶[4]。研究发现，TNF-α是新生血管生成的潜在诱导剂，通过促进异位病灶周围新生血管的形成，促使异位子宫内膜得以生长、增生、分化[5]。本实验结果表明，丹赤胶囊能降低巧克力囊肿患者异位内膜细胞培养上清液中的TNF-α水平，提示这种中药制剂通过下调具有促血管生成作用的细胞因子TNF-α的分泌及活性，抑制病灶周围新生血管的形成，使异位内膜失去了赖以生存的物质基础——血液供应，阻止了异位内膜的种植、进一步增殖和浸润，促使异位内膜萎缩，进而消失。
研究表明，子宫内膜异位症患者腹腔液和异位内膜细胞中MCP-1的浓度升高，它能募集并激活外周血中单核细胞进入腹腔进而转化为巨噬细胞，从而导致炎症反应[6]。子宫内膜腺上皮和间质细胞均能合成和分泌MCP-1。本实验结果表明，丹赤胶囊能明显降低巧克力囊肿异位内膜细胞上清液MCP-1水平，其中以丹赤大、中剂量组和西药丹那唑组降低明显。提示丹赤胶囊通过下调MCP-1水平，从而减轻了局部免疫与炎症反应，使病灶及周围组织炎性浸润减少，松解盆腔局部粘连，阻止异位症的进一步发展。本研究结果提示，丹赤胶囊通过降调参与子宫内膜的粘附种植-血管生成-浸润发展这3个阶段的细胞因子的水平及活性，抑制子宫内膜细胞的粘附种植，减少其周围的血液供应，阻止子宫内膜细胞在盆腔的进一步游走、播散，减轻病灶及其周围的炎症粘连，达到治疗子宫内膜异位症的目的。
【参考文献】
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