作者：唐海英，王冬春，檀爱民，马世平，刘康，狄留庆
【摘要】 摘要：目的 以去卵巢老龄大鼠为实验对象，观察仙灵强骨口服液对绝经后骨质疏松症的影响。方法 50只7月龄SD大鼠去除卵巢后，随机分为5组：模型组、尼尔雌醇组、仙灵强骨口服液高剂量组、仙灵强骨口服液中剂量组、仙灵强骨口服液低剂量组，同时设假手术组。手术结束后第3天开始给药，连续90 d。所有大鼠给药80、87 d时两次ip四环素20 mg/kg进行骨荧光标记；给药末日股动脉放血，收集血液，分离出血清，测定ALP及StrACP；取出大鼠股骨及第四腰椎骨进行骨密度、骨形态计量学、骨生物力学测定。结果 仙灵强骨口服液能显著降低血清StrACP水平，提高椎骨刚性，增加股骨，破坏载荷及刚度，增高骨小梁体积，降低单标表面、双标表面、类骨表面、类骨质宽、成骨表面、吸收表面、矿化率及矿化时间。结论 仙灵强骨口服液对绝经后骨质疏松症模型大鼠有预防作用。
【关键词】 仙灵强骨口服液；骨质疏松症；卵巢切除；大鼠
Abstract：Objective To study the effects of Xianlingqianggukoufuye (XLQGKFY) on postmenopausal steoporosis in ovariectomized female rats. Method 60 female Sprague-dawley rats in 7-month were used， 50 of them were ovariectomized and randomly pided into 5 groups：ovariectomized (OVX)， OVX+ Nylestriol， OVX+XLQGKFY (high dose， middle dose， low dose)， the others were sham-operated group. Rats were treated with drugs starting at 3rd day after the operation for 90 days. Double in vivo fluorochrome labeling was administered to all rats. At the end-point of study， the blood was collected to detecte contents of ALP， StrACP in serum， the fourth lumar vertebra (LV4) and femur bone sections were cut and stained for bone histomorphometric analyses， biomechanical analyses and BMP analyses. Result XLQGKFY decreased greatly the StrACP content， increased bone stiffness， bone M-load， improved bone biomechanical property. Conclusion XLQGKFY has a good preventive effect on postmenopausal osteoporosis which provides for clinical use. Key words：Xianlingqianggukoufuye；postmenopausal osteoporosis；ovariectomy；rat 本实验通过测定去卵巢老龄大鼠骨形态计量学、骨生物力学、骨密度以及血清碱性磷酸酶(ALP)、酒石酸酸性磷酸酶(StrACP)水平等指标，观察仙灵强骨口服液对骨质疏松症的预防作用。
1 实验材料
1.1 动物 SD雌性大鼠60只，7月龄，上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。1.2 药物 仙灵强骨口服液，江苏先声药物研究有限公司提供，批号021225；尼尔雌醇片(E3)，上海华联制药有限公司生产，批号20020502。1.3 试剂和仪器 ALP试剂盒及StrACP试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；DPX-IQ骨密度测量仪(LUNAR公司产)，应用软件Small Animal Total Body Acquisition；双能X线骨密度仪(HOLOGIC 4500A，美国)，Small animal analyze软件；荧光显微镜(OLYMPUS-BHT)；MPIAS-500彩色病理图文分析仪(同济医科大学清平影像公司产)；AGS-10KNG(岛津)万能材料试验机；HP Scanjet 5470c扫描仪；Image-Pro Plus图像处理系统；721型分光光度计(上海第三分析仪器厂产)。
2 实验方法
2.1 造模
大鼠ip 0.7%戊巴比妥钠35 mg/kg麻醉，俯位固定，在背部脊柱两侧切口，于无菌条件下假手术组不摘除卵巢，仅去除部分脂肪；造模大鼠则摘除双侧卵巢[1]。
2.2 分组及给药
大鼠在手术45 d后随机选取假手术组鼠及造模组鼠各10只，戊巴比妥钠麻醉后进行活体骨密度测量，统计结果表明，模型组大鼠骨密度明显降低。将造模大鼠随机分为5组，即模型组、阳性药组及仙灵强骨口服液高、中、低3个剂量组。所有大鼠在手术3 d后灌胃(ig)给药：假手术组及模型组给予蒸馏水5 mL/kg；阳性药组灌胃1.0 mg/kg尼尔雌醇；给药组分别给予1.5、3、6 g/kg仙灵强骨口服液。除阳性药组大鼠隔天给药外，其余大鼠均每天给药，连续90 d。所有大鼠给药80、87 d时2次ip四环素20 mg/kg进行骨荧光标记。
2.3 观察指标和测定方法
2.3.1 血清指标测定
给药末日股动脉放血，收集血液，分离出血清，测定ALP及StrACP。
2.3.2 形态计量学的测定
取出大鼠股骨及第四腰椎骨，分离周围结缔组织后，将大鼠骨标本置于70%酒精，4 ℃固定7 d，再分别置于80%、90%酒精及无水丙酮脱水2次，各1 d。经二甲苯透明2次(各24 h)后，浸于3/7比例的甲基丙烯酸丁酯/甲酯16 h，包埋、固化于3/7比例的半聚合的甲基丙烯酸丁酯/甲酯中(40 ℃约1周)；用切骨机切7 μm厚不脱钙连续切片4张，分别进行Gemisa、von Kossa染色；采用光镜与荧光显微镜进行病理组织学与骨组织形态计量学观察。组织学观察采用Gemisa染色、普通光源；类骨质观察采用von Kossa染色；四环素标记观察用荧光显微镜。采用彩色病理图文分析仪进行测定和计算。
2.3.3 股骨骨密度测定
双能X线骨密度仪用标模进行标定。取股骨样品置骨密度仪扫描台上，测定骨影面积(EARE)、骨矿含量(BMC)和骨密度(BMD)。
2.3.4 大鼠股骨三点弯曲实验
将试样从-20 ℃的冰箱中取出，自然解冻。用牙托粉将股骨两端包埋，制作成稳定支座。用游标卡尺测量试样中点(受压点)的直径，经向纬向各测1次，求平均值。将制备好的试样置于试验机上进行三点弯曲实验。压头速度5 mm/min，量程500 N(自动)，跨距20 mm。计算机处理系统实时监测实验过程，自动求出每批试样测量值。
2.3.5 大鼠椎体压缩实验
将试样从-20 ℃冰箱中取出，自然解冻。小心去除后部脊突等小关节后，用800#水砂纸仔细打磨平滑，去掉椎体上下终板，将试样两端打磨成上下平行的平面。用扫描仪将每组试样进行扫描，用图像处理系统测定试样截面积。将制备好的试样置于试验机压盘中心进行压缩实验。压盘速度2 mm/min，量程500 N(自动)，压缩最大行进距离3 mm。计算机处理系统实时监控测验过程，自动得出每批试样测量值。
2.4 统计学方法
计量资料均采用x±s表示，各给药组与对照组之间差异采用Student-t检验。
3 结果
(见表1～表7)表1 大鼠摘除卵巢后骨密度(略)注：与假手术组比较，＃P&<0.05。表2 仙灵强骨口服液对去势大鼠血清ALP及StrACP的影响(略)注：与模型组比较，*P&<0.05，**P&<0.01。 表3 仙灵强骨口服液对去势大鼠椎体压缩力学的影响(略)注：与假手术组比较，#P&<0.05，##P&<0.01，###P&<0.001；与模型组比较，*P&<0.05，**P&<0.01，***P&<0.001(下同)。表4 仙灵强骨口服液对去势大鼠股骨弯曲力学的影响(略)表5 仙灵强骨口服液对去势大鼠股骨形态计量学的影响(略)表6 仙灵强骨口服液对去势大鼠股骨密度的影响(略)表7 仙灵强骨口服液对去势大鼠体重的影响(略)
4 讨论
骨质疏松症的主要特征为骨强度降低、骨脆性增加、易致骨折[2]，而其防治的重点在于保护和提高骨质量。骨质量包括骨组织的“质”和“量”两个方面，骨密度代表骨“量”，骨骼微细结构和骨生物力学性能是判断骨“质”不可或缺的主要指标。骨“质”和骨“量”共同决定着骨的强度[3]。近年来，已有不少学者认识到骨形态计量学与生物力学变化的重要性，将其作为评价骨质疏松的“黄金指标”，与骨密度等指标一起作为动物模型和药物疗效的评价指标[4-5]。
本实验结果显示，尼尔雌醇可明显降低StrACP水平，在一定程度上增加ALP活性，对骨形态计量学多项指标均有明显改善作用，并能明显增加弹性模量、最大载荷、刚性及面积。仙灵强骨口服液可提高大鼠体内血清ALP活性，与其对体外培养成骨细胞ALP活性影响的结果一致，同时亦可降低StrACP活性。此外，虽然其不能明显增加股骨密度，但能明显提高骨小梁体积百分率、矿化率，降低骨吸收表面百分率及矿化时间，对其它多项检测指标亦有不同程度的改善，从总体水平上提高模型鼠的骨质量。其中，在改善模型大鼠的多项骨生物力学及形态学指标上，仙灵强骨口服液高剂量组与尼尔雌醇作用相当。
实验结果表明，仙灵强骨口服液对绝经后妇女骨质疏松症有较好的预防作用，这为其临床应用提供了实验依据。仙灵强骨口服液的作用机理可能与其提高体内激素水平、促进成骨细胞增殖、提高ALP活性有关，其详细作用机制有待进一步研究。
【参考文献
】
1] 孙敬方.动物实验方法学[M].北京：人民卫生出版社，2001.423.
[2] Kanis JA， Melton LJ， Christiansen C， et al. The diagnosis of osteoporosis[J].J Bone Miner Res，1994，9：1137－1139.
[3] 肖鲁伟，詹红生.骨折风险预测与骨量、骨质量检测[J].浙江中医学院学报，2002，24(5)：7－8.
[4] 林燕萍，周瑞祥，郭世明，等.健骨颗粒对去卵巢骨质疏松模型大鼠骨质量的影响[J].中国西医结合">中西医结合杂志，2004，24(5)：431－434.
[5] 邓虹珠，梁 磊，张绪慧.益妇宁软胶囊对去卵巢大鼠骨形态和生物力学性能的影响[J].中国中药杂志，2006，31(3)：228－231.