鲍曼不动杆菌耐药机制的分析进展

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论文字数:**** 论文编号:lw2023107477 日期:2025-06-28 来源:论文网
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   鲍曼不动杆菌广泛存在于医院环境中,如医护人员手部、患者用具、呼吸机设备、消毒液、透析机、水龙头等[1],是最常见的条件致病菌之一,可以引起多种医院感染,如肺炎、伤口感染、败血症和脑膜炎等。近年来随着抗菌药物的广泛应用,耐药株逐年增加,并从对单一抗菌药耐药向多重耐药、由低耐药向高耐药发展,因此对鲍曼不动杆菌耐药机制已成为普遍关注的研究热点。
  目前,临床治疗不动杆菌的主要药物是β-内酰胺类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类等。本文就鲍曼不动杆菌对这几类药物的耐药机制的研究现状作一阐述。
  1 对β-内酰胺类抗菌药物的耐药机制
  1.1 β-内酰胺酶的产生
  β-内酰胺酶的产生是鲍曼不动杆菌耐药最主要的原因,包括超广谱β-内酰胺酶类(属A类,由TEM型、SHV型、SIM型和PER型等基因编码)、金属酶类(属B类,由IMP和VIM基因编码)、AmpC酶(属于C类),OXA型酶(属D类)等四类。细菌主要通过质粒介导或染色体突变诱导细菌产生β-内酰胺酶,β-内酰胺酶与参与细菌细胞壁肽聚糖代谢的D-丙氨酸-D-丙氨酸肽酶的三维结构十分相似,从而以水解和非水解方式破坏β-内酰胺环,使抗菌药物失去活性[2]。
  1.1.1 超广谱β-内酰胺酶
  超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)又称氧亚氨β-内酰胺酶,是细菌质粒介导的能水解甲氧亚氨基β-内酰胺类抗生素,如头孢他啶、头孢噻肟,以及氨曲南等的β-内酰胺酶,由于ESBLs能水解青霉素类、头孢菌素及单环类抗生素,作用底物广泛而称之。ESBLs大部分属Ambler A类酶,位于Bush等功能分类方案2be群;少数属于Ambler的D类,位于Bush的2d群。ESBLs超过240种,按传统的ESBLs分类法,可分为TEM型、SHV型、非TEM及非SHV型等(包括CTX-M、OXY、SIM、PER等)。
  TEM型ESBLs有71种,其中TEM-1是革兰阴性菌中最为常见的β-内酰胺酶[2]。TEM-2基因的转座子介导对青霉素的耐药[3]。TEM-1、TEM-2广泛存在,是不动杆菌属对β-内酰胺类抗菌药物耐药的主要机制。TEM型酶突变位点主要在TEM-104、TEM-164、TEM-238、TEM-240。其中164、238位点突变将导致催化腔体积增大,使分子结构较大的第三代头孢菌素能够进入;在此基础上,104、240等位点的突变使酶对第三代头孢菌素的亲和力增强,进一步提高其水解效率。另外突变的位点不同其水解效率也不同,如238位点的突变主要促进酶对头孢噻肟的水解,而240等位点的突变主要促进酶对头孢他啶的水解,所以抗生素的使用情况不同,ESBLs的类型在不同国家和地区是不同的。
  SHV型ESBLs有28种,其中SHV-1最为常见,有20%对氨苄青霉素耐药[2]。SHV型酶突变位点集中在SHV-179、SHV-205、SHV-238、SHV-240,其中SHV-238、-240位点突变分别对水解头孢他啶和头孢噻肟起关键作用。有研究发现30%鲍曼不动杆菌携带由质粒介导的SHV酶,并首次发现SHV-12亚型带有ESBLs基因[4]。
  CTX-M属非TEM和非SHV起源的ESBLs,包括CTX-M1-10、Toho-1和Toho-2,对头孢噻肟水解能力强,而对头孢他啶水解能力弱,因此体外药敏试验中产生此酶的菌株常对头孢噻肟耐药而对头孢他啶较敏感[2]。此群酶与TEM和SHV型酶仅有40%左右的同源性。主要见于大肠埃希菌、沙门菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形菌,目前在不动杆菌属中尚未发现。
  OXA型ESBLs目前发现有46种以上,对氨苄青霉素、头孢噻吩耐药,能高度水解苯唑西林、氯唑西林。OXA型β-内酰胺酶之间同源性较低,不到20%。
  1.1.2 AmpC酶
  AmpC酶属于β-内酰胺酶Bush-J-M1群,它们在分子结构上具有同源性,都属于β-内酰胺酶分子分类中的C类[5]。在自然状态下细菌产生此种酶的量很少,但在β-内酰胺类抗生素(如头孢西丁、亚胺培南和克拉维酸)的作用下可大量诱导AmpC酶的产生,而且其调控基因的突变率很高,突变后将使酶持续大量产生,导致细菌对除碳青酶烯类之外的所有β-内酰胺类抗生素耐药。
  AmpC酶可分为诱导型、去阻遏持续高产型和质粒型。染色体AmpC酶的结构基因为AmpC,参与调控的基因有ampR、ampD、ampG与ampE等。AmpR和AmpD蛋白形成复合物,抑制AmpC基因转录。诱导剂可与AmpD蛋白结合,致使AmpD蛋白不能与AmpR形成复合物,AmpR发挥激活作用,导致AmpC酶合成增加。当AmpD基因突变,产生功能有缺陷的AmpD蛋白,使AmpD蛋白不能与AmpR蛋白形成复合物,导致AmpC酶合成持续增加;当AmpR基因突变,产生功能有缺陷的AmpR蛋白,则无论AmpD蛋白是否存在,都不能激活AmpC基因转录,AmpC酶合成减少。但是,上述酶的诱导合成是一个短暂现象,当诱导剂与有功能的AmpD相互作用,从而阻止AmpD与AmpR蛋白形成复合物时,AmpR激活AmpC基因转录。与此相反,基因的去阻遏是一个持久现象,可能是由于AmpD基因突变,合成有缺陷的AmpD蛋白,不能与AmpR蛋白形成复合物,从而导致AmpR激活AmpC基因持久转录[6]。绝大多数革兰阴性杆菌都具有产生AmpC酶的能力,通常产酶量很少,在临床上并不形成耐药;由于AmpC的调节基因AmpD有很高的自发突变率,而使AmpC变为稳定的去阻遏状态[7],细菌就可持续高产AmpC酶,出现对绝大多数β-内酰胺类抗菌药物的耐药。此外还注意到,细菌一旦同时具有高产AmpC酶及产ESBLs的能力,其耐药性将极其严重,给临床治疗带来严重威胁。
  1.1.3碳青霉烯酶
  碳青霉烯酶是指能够明显水解亚胺培南或美罗培南的β-内酰胺酶。按Ambler分子分类为A、B、D三类酶[8]。A类、D类为丝氨酸酶,属于Bush分群中的第2f和2d亚组,A类酶见于一些肠杆菌科细菌,D类酶仅见于不动杆菌;B类酶为金属酶,属于Bush分群中的第三组,见于铜绿假单胞菌、不动杆菌、肠杆菌科细菌。
  D类酶即OXA酶,对亚胺培南的水解速率是对青霉素水解速率的1%~3%,对苯唑西林的水解速率是对青霉素水解速率的2倍,对第三代头孢菌素的水解活性弱。按氨基酸同源性分为两组,OXA-23、OXA-27和OXA-49为一组,同源性为99%,其有较高的头孢菌素水解活性,对亚胺培南的水解活性较弱;第二组包括OXA-24、OXA-25、OXA-26和OXA-40,同源性为98%;两组之间的同源性为60%。这些酶在氨基酸81~84位都保持STFK(Ser-Thr-Phe-Lys)的四联体结构,在126~128位保持SXV(Ser-Ala-Val)的三联体结构,但在第三个保守基序YGN(Tyr-Gly-Asp)却被FGN(Phe-Gly-Asp)所取代,从而能水解亚胺培南,OXA-23、OXA-27仍保留了KTG结构,但在OXA-24、OXA-25、OXA-26中突变为KSG;OXA-23对苯唑西林具有很强的水解活性,但对氨苄西林却相对较弱,而OXA-27对这类抗菌药物都只具有弱的水解活性[9]。此外,OXA-23的保守序列的点突变也与它对碳青霉烯类抗菌药物耐药有关[10]。
  金属酶因需要金属离子如Zn2+等的转移而表现其催化活性,故称为金属β-内酰胺酶。金属β-内酰胺酶的特点是水解底物广,能够水解包括碳青霉烯类在内的几乎所有β-内酰胺类抗菌药物,临床上尚无有效的抑制剂。根据氨基酸的同源性,Bush把金属酶分成三组结构亚型B1、B2、B3[11],在鲍曼不动杆菌中发现的主要是B1亚型,包括IMP类以及VIM类。酶分子量在28 kD左右,其氨基酸同源性为23%。
  目前在不动杆菌属中只发现了四种IMP类金属酶:IMP-1、IMP-3和IMP-4、IMP-7[12-14],能使细菌耐碳青霉烯类、头孢他啶、拉氧头孢羧苄西林,而哌拉西林和氨曲南敏感性不受影响。VIM型金属酶家族包括VIM-1、VIM-2、VIM-3。VIM酶与IMP酶的同源性小于40%,但两个酶系具有相同的动力学特征。VIM-2型基因位于I型整合子中。VIM型基因可在不同种属细菌间传播。
  1.2 青霉素结合蛋白(PBPs)和外膜通透性的改变
  β-内酰胺类抗生素发挥作用的关键是药物能否穿透外膜进入细菌体内并作用于内膜上的青霉素结合蛋白。β-内酰胺类抗生素通过与PBPs结合发挥药效。当PBPs发生改变时,抗生素不能结合或亲和力降低,则产生耐药[15]。PBPs的改变包括:(1)PBPs数量改变或缺失;(2)药物与PBPs亲合力降低;(3)细菌产生缓慢结合的PBPs;(4)诱导性PBPs的出现。
  革兰阴性菌的外膜蛋白是镶嵌在细胞壁脂质双层的蛋白质,主要有两种:分子较大的OmpF和分子较小的OmpC。外膜是革兰阴性菌的重要结构,其屏障功能改变介导的耐药性包括外膜通透性降低和主动外排(泵出)两种机制。革兰阴性菌的外膜是抗菌药物与细菌接触的第一道防线,外膜屏障作用是孔蛋白所决定的。外膜屏障与β-内酰胺酶有协同作用,即外膜渗透性降低和主动外排导致的β-内酰胺耐药[16]。由于突变导致OmpF和/或OmpC改变或表达减少将使细菌对多种β-内酰胺类抗菌药物敏感性下降。细菌发生突变可以造成孔蛋白的丢失或降低其表达,均会影响药物从细胞外向细胞内的运输,使抗菌药物不能达到作用靶位而发挥抗菌效能。29 kD、22 kD、33-36 kD以及46 kD外膜蛋白的缺乏是不动杆菌耐碳青霉烯类原因之一[17-20]。
  膜蛋白可将许多不同结构的抗菌药物主动排出菌体,从而容易造成细菌的多重耐药。据报道,鲍曼不动杆菌的多重耐药与AdeABC外排泵过度表达有关[21]。鲍曼不动杆菌对氟喹诺酮类药物和亚胺培南等耐药都与外排机制有关[8,22]。
  2 对氨基糖苷类抗菌药物的耐药机制
  尽管氨基糖苷类抗菌药物的副作用限制了其在临床的应用,但由于其与β-内酰胺类抗菌药物联用具有协同作用而仍广泛用于临床治疗不动杆菌的感染。不动杆菌对氨基糖苷类抗菌药物产生耐药的机制包括:①编码核糖体蛋白质的基因突变导致核糖体结构的改变;②编码孔道蛋白的基因自然突变导致外膜的不可渗透性;③钝化酶的修饰作用。其中第一种机制仅影响链霉素和壮观霉素,在临床上意义不大。第二种机制涉及质子电化学梯度、呼吸链和脂多糖的改变,在所有氨基糖苷类抗菌药物的抗性转移中发挥作用。第三种机制是不动杆菌耐药最为重要的机制。不动杆菌对氨基糖苷类抗菌药物的耐药主要是通过质粒或转座子编码的钝化酶(如乙酰化酶、磷酸化酶、腺苷化酶等)实现的[23]。不动杆菌产生三类氨基糖苷类钝化酶,催化游离羟基磷酸化的氨基糖苷磷酸转移酶(APH),作用于氨基糖苷类抗菌药物的3’-、2’-及6’-位,修饰依赖于ATP的氧化磷酸化;催化游离羟基核苷化的氨基糖甙核苷转移酶(ANT),作用于氨基糖甙类抗菌药物的4’-和2’-位,修饰依赖于ATP的腺苷化;催化氨基乙酰化的氨基糖甙乙酸转移酶(AAC),作用于氨基糖甙类抗菌药物的3’-和2’-位,修饰依赖于乙酰辅酶A的N-乙酰化。这些氨基糖甙类修饰酶,能将氨基糖甙类抗菌药物的游离氨基乙酰化,游离羟基磷酸化、核苷化,使药物不易进入菌体内。
经钝化酶修饰后的氨基糖甙类抗菌药物不能与核糖体30S亚基结合,丧失了干扰细菌核糖体功能的作用,从而失去抑制蛋白质合成的能力,而且经钝化酶修饰后的抗菌药物能与未经修饰的抗菌药物竞争细菌内转运系统,从而降低了后者的抗菌效率。此外基因突变导致膜的不可渗透性而影响能量转换,从而减少氨基糖甙类抗菌药物的吸收,导致对大多数氨基糖苷类抗菌药物低浓度交叉耐药。如鲍曼氏不动杆菌BM4454的药物主动泵出系统。溴化乙啶吸收试验证明了adeB介导的质子梯度依赖性主动泵出系统的存在[21]。

   3 对氟喹诺酮类抗菌药物的耐药机制
  不动杆菌获得对氟喹诺酮类抗菌药物耐药的机制有:①药物作用靶位的结构基因突变致DNA旋转酶(拓扑异构酶II)和拓扑异构酶IV突变;②外膜通透性的限制和主动流出泵外排系统。其中染色体基因突变引起靶酶DNA旋转酶的改变,是不动杆菌对氟喹诺酮类抗菌药物的主要耐药机制[24]。
  DNA旋转酶为2个A亚基和2个B亚基组成的四聚体,分别由gyrA基因和gyrB基因编码,是一种与DNA复制、整合及转录表达有关的酶。拓扑异构酶IV,由2个C亚基和2个E亚基组成,分别由parC基因和parE基因编码,在DNA复制后期姊妹染色体分离过程中起重要作用。DNA旋转酶催化DNA逆向超螺旋,参与DNA的切断与复制。当氟喹诺酮类抗菌药物抑制DNA旋转酶活性时,将阻止DNA复制、修复、转录、染色体的分离和其它功能,从而达到杀菌的目的。不动杆菌属对氟喹诺酮类抗菌药物耐药的主要机制是gyrA基因和parC基因突变的结果。不动杆菌gyrA基因突变与高水平的氟喹诺酮类抗菌药物耐药有关[21]。gyrA或parC基因突变而引起DNA旋转酶的结构改变,低了氟喹诺酮类抗菌药物对这种酶的亲和力[25]。gyrA的改变引起耐药的原因可能有两种:一种是由于酶结构的改变引起空间上的位阻,阻止氟喹诺酮类抗菌药物进入药物作用区;另一种是由于物理化学变化干扰氟喹诺酮类药物-酶-DNA相互作用[26]。拓扑异构酶IV的改变,也将产生对氟喹诺酮类抗菌药物的低水平耐药。当gyrA基因和parC基因同时发生突变时,则表现出高水平的耐药。
  细菌细胞膜上的主动泵出系统是一类蛋白质,在能量的支持下,可将药物选择性或非选择性地排出细胞。在多种细菌中都已发现主动泵出系统。在不动杆菌中发现的主动泵出系统为耐药结节分化家族,能够泵出鎘、钴和镍离子的转运蛋白[27]。由于膜蛋白可将许多不同结构的抗菌药物排出菌体,从而容易造成细菌的多重耐药。膜蛋白的活性依赖跨膜的质子梯度。有报道,鲍曼氏不动杆菌决定细胞内药物吸收量的和药物主动排出系统的基因突变导致介导氟喹诺酮类抗菌药物吸收的外膜蛋白表达量降低,或者刺激细胞的主动排出系统排出药物[25]。
  4 对其他抗菌药物的耐药机制
  氯霉素与细菌50S核糖体亚基结合,阻止酰基转移酶参与蛋白质的合成。不动杆菌对氯霉素的耐药主要是与质粒编码的氯霉素乙酰基转移酶灭活作用、外膜蛋白通透性降低或主动泵出系统活性增强有关。自然界细菌对四环素耐药最为多见,其发生机制主要为获得外源性DNA编码产生四环素泵出系统,或具有核蛋白体保护作用的蛋白质,也可以因为染色体突变导致外膜渗透性降低。四环素是通过被动扩散进入细菌细胞与30S核糖体结合,从而抑制蛋白质的合成。不动杆菌对四环素耐药主要是耐药基因tetM编码可溶性蛋白质和延伸因子G相关蛋白与核糖体结合,保护核糖体,从而阻断四环素对蛋白质合成的抑制作用,此外不动杆菌还有能量依赖性外排系统,可在四环素到达靶位核糖体前将其泵出。不动杆菌耐药通常是多重的,这种多重耐药通常是由于整合子、质粒和Tn27介导的转化、转导等而引起多种耐药因子联系在一起,呈现多重耐药现象[26]。
  5 展望
  不动杆菌对临床使用的多种抗菌药物均有不同程度的耐药,其机制涉及灭活酶的产生、基因突变所致的靶位/结合改变、外膜的通透性降低以及主动外排系统功能增强等。同时,携带抗性基因的质粒或转座子可以通过接合方式转移,从而加剧了耐药性该菌中的传播,给临床治疗带来了很大的困难。深入研究细菌的耐药机制,不断研制和开发新的抗菌药物以及采取有效抗菌措施,将成为今后的研究方向。
参 考 文 献
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