【摘要】目的 研究皮肤创面诱导凝胶（商品名：创无痕）对创面愈合的影响。方法 对34处应用皮肤创面诱导凝胶（治疗组）及34处常规处理（对照组）的兔耳创面的愈合情况及愈合时间进行观察，并进行比较。结果 治疗组的切口愈合时间（13.4±1.3）d ，较对照组（17.6±1.6）d（P&<0.01）缩短，治疗组创面愈合后瘢痕较对照组更轻微。结论 皮肤创面应用皮肤创面诱导凝胶能缩短创面愈合的时间及减轻创面愈合后瘢痕。
【关键词】 重组人表皮生长因子 三氯生 创面愈合 瘢痕
创伤修复是一个常见的病理过程，其中瘢痕修复是最主要的修复过程。表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）是体内多种组织及体液中的一种多肽生长因子。重组人表皮生长因子（recombinant human epidermal growth factor，rhEGF）已作为一种用于多种创面治疗的药物，在烧伤创面和各种慢性创面的治疗中显示出较好的临床效果[1]，但对创面愈合后瘢痕形成的研究非常少。皮肤创面诱导凝胶（商品名：创无痕）是一种由重组人表皮生长因子、卡伯姆、三氯生组成的复合凝胶制剂。我们现采取对照研究，观察皮肤诱导凝胶对创面愈合及愈合后瘢痕形成的影响，以期为rhEGF最适的临床应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 研究对象 选取34只健康日本圆耳兔（山西省药检所提供），雌雄不限，体重2～2.5kg，混合饲料单笼喂养。实验动物的左耳为实验组，创面涂抹创无痕；右耳为对照组，创面涂抹生理盐水。
1.2 兔耳创面模型建造 实验前一天对34只兔子的68只耳朵内侧根部进行砂布打磨，打磨面积为1cm×1cm，打磨深度以创面有血液渗出为准。
1.3 实验方法 每只兔子的左耳创面涂抹0.5mg创无痕，右耳涂抹生理盐水，每日换药至创面愈合为止。观察至兔耳创面愈合，每3日随机处死动物6只进行观察，测量创面的面积及制作病理切片，共观察四组，剩余10只观察创面完全愈合的时间。
1.4 检测指标 每天观察创面愈合情况，在伤后3、6、9、12d行创面照相，以肉眼观察创面表面有完全上皮覆盖作为创面愈合时间的依据，记录各组实验动物创面的愈合时间，计算出平均愈合时间。每组在相同时段取创面组织标本，以观察病理组织学的变化情况：
①创面愈合率的计算 每6只兔子于伤后3、6、9、12d采用透明胶片描记加称重法测定创面面积，并按下列公式计算创面愈合率:愈合率=[(原始创面面积-未愈合创面面积)/原始创面面积]×100%。②组织学观察将10%甲醛固定的标本，逐级酒精脱水，常规石蜡包埋切片，行HE和VG(观察胶原)染色，进行光镜组织观察并照相：观察表皮结构、真皮与表皮邻接处的微水疱、胶原束和皮肤结构、表皮再生。③创面羟脯氨酸(OHP)含量检测羟脯氨酸含量测定用化学比色法，具体操作按测试盒说明书进行。④创面Ⅰ/Ⅲ型胶原比例测定胶原提取采用乙酸—胃蛋白酶法[2]，胶原检测采用酶联免疫吸附试验[2]。
1.5 统计学分析 实验所得数据均以x±s表示，用t检验比较组间差异，
P&<0.05 者为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 动物一般状况 所有动物在喂养期间活动好，食欲可，体重较稳定。
2.2 创面愈合时间 实验组创面愈合情况良好，愈合时间为（13.4±1.3）d，对照组创面愈合相对缓慢，愈合时间为（17.6±1.6）d，两组对比，实验组创面愈合时间明显短于对照组。两组间比较差异有统计学意义(P&<0.01) 。
2.3 创面愈合率见表1：
表1 不同时间创面愈合率的比较(%，x-±s)
Tab1 Comparison of wound healing rate at different times (%，x-±s)
时间(d) 3 6 9 12
实验组(n=6) 31.90±4.48 76.27±12.93 89.03±4.02 99.13±1.89
对照组(n=6) 24.13±8.07 47.34±12.96 68.75±8.13 89.98±2.24
实验组与对照组比较均: P&<0.01
2.4 组织学观察结果 伤后3d，皮肤创面诱导凝胶实验组和生理盐水对照组创面均可见表皮细胞增殖，创面内新生毛细血管开始形成；伤后6d可见毛细血管、成纤维细胞，并见较多炎症细胞浸润，但实验组创面肉芽组织灶更明显，细胞及血管含量更丰富；伤后9d，实验组较对照组创缘上皮增殖更明显，创面内成纤维细胞及毛细血管数目更多；伤后12d，实验组创面新生表皮细胞已基本覆盖伤口，并可见明显角化，创面组织中成纤维细胞大部分转化为纤维细胞，毛细血管数少于对照组创面，对照组创面成纤维细胞增殖较活跃，纤维细胞数目少。实验组与对照组第3天、第12天的组织学观察结果分别见图1、图2：
图1. 实验组与对照组第12天组织观察学结果
2.5 创面羟脯氨酸含量及Ⅰ/Ⅲ型胶原比例见表2与表3：
表2 创面羟脯氨酸含量(μgPmg?prot)
Tab 2 Hydroxyproline contents (μgPmg?prot)
时间(d) 3 6 9 12
实验组(n=6) 1.13±0.17 2.37±0.71 2.54±0.39 2.85±0.57
对照组(n=6) 0.92±0.14 1.23±0.31 1.71±0.36 1.83±0.49
实验组与对照组比较均:P&<0.05
表3 Ⅰ/Ⅲ型胶原比例(%，x±s)
Tab 3 Ratio of collagen Ⅰ/Ⅲ of wound(%，x±s)
时间(d) 3 6 9 12
实验组(n=6) 3.98±0.45 3.23±0.24 2.51±0.14 2.01±0.26
对照组(n=6) 3.75±0.32 3.63±0.29 2.98±0.16 2.54±0.27
实验组与对照组比较均:P&<0.05
3 讨论
皮肤伤口愈合是一个复杂的生物学过程，是由成纤维细胞增殖分化、新生血管形成、细胞外基质纤维化和表皮细胞增生覆盖创面等共同作用的结果[3]。生长因子是一类能调节细胞生长和分化、促进组织愈合的多肽或蛋白质，由非腺体细胞以旁分泌或自分泌的方式产生，在体内浓度极低，但却有着广泛的生物学活性。EGF生物活性是通过与表皮生长因子特异性受体(epidermal growth factor receptor specificity， EGFR) 结合而实现的，EGF 通过与胞膜EGFR 结合引起膜受体胞内段酪氨酸蛋白激酶磷酸化，导致蛋白G和磷酸脂酶C激活等一系列生化反应而发挥生物学作用，造成细胞内游离Ca2+增多，促进糖酵解及DNA 和RNA、蛋白质的合成，从而促使与组织修复相关的成纤维细胞和内皮细胞等分裂、增殖以及细胞外基质的合成与分泌，加速创面愈合[4]，但在创面修复过程中，EGF含量远低于EGFR，不能有效促进创面愈合。外源性rhEGF的补充一方面可促进内源性EGF的表达，刺激组织分泌EGF，另一方面，也可以补充创面内源性EGF的相对不足，加速创面的愈合。因此，补充外源性rhEGF，可以最大限度地发挥EGF本身的生物学作用，从而有效的加速创面愈合。
皮肤创面修复过程中形成的结缔组织主要成分是成纤维细胞及其产生的胶原蛋白。创面成纤维细胞不仅可以分泌胶原，而且可以合成糖蛋白、蛋白多糖等细胞外基质成分，具有调节细胞生长、增殖、分化和迁移等功能。正常皮肤以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主，肉芽组织中以Ⅲ型胶原为主，肉芽组织的纤维化使创面呈瘢痕修复。Warren等通过将正常成人皮肤的成纤维细胞及表皮细胞培养于不含细胞因子和血清成份的培养基中，观察了表皮细胞对成纤维细胞胶原合成及增值作用。研究发现，在含有表皮细胞的培养基中，成纤维细胞的增值明显增加而胶原合成减少[5]。因此，在创伤早期应用表皮生长因子能有效减少瘢痕的形成。
皮肤诱导凝胶治疗兔耳创面，创面面积明显缩小，愈合速度快，与盐水对照创面比较相差显著(P&<0.01)，使用皮肤诱导凝胶的创面完全愈合时间较对照组平均提前4d(P&<0.01)。表明皮肤诱导凝胶具有促进表皮细胞增殖、分化，加速了创面愈合过程。皮肤创面诱导凝胶实验组创面与生理盐水对照组创面相比较，早中期成纤维细胞、炎症细胞及毛细血管数量明显增多，成纤维细胞转化为纤维细胞的时期提早，胶原沉积量显著增加，表皮基底细胞增殖较活跃，创面愈合时间明显短于对照组；同时皮肤创面诱导凝胶治疗组创面周边新生毛细血管明显多于生理盐水对照组创面，说明皮肤创面诱导凝胶在创面愈合过程中能有效促进肉芽组织生长及伤口再上皮化、新生血管形成。在皮肤创面诱导凝胶实验组和生理盐水对照组中羟脯氨酸的含量逐渐增加、Ⅰ/Ⅲ型胶原比例逐渐降低，而实验组创面明显优于对照组创面，说明皮肤创面诱导凝胶能更有效的促进创面愈合且愈合后能有效抑制瘢痕形成。创面愈合基于肉芽组织的形成及上皮化，皮肤创面诱导凝胶能明显增加创面羟脯氨酸的含量，改变Ⅰ/Ⅲ型胶原比例，有效的促进了创面的愈合，减短了创面的愈合时间，更有效的抑制了创面愈合后的瘢痕形成。因此，本外用药物可以安全的用于临床治疗。
参 考 文 献
[1]王光毅，夏照帆，朱世辉等，应用表皮生长因子治疗深Ⅱ度烧伤创面的远期临床疗效观察[J].中华烧伤杂志，2003， 19（3）；167-168.
[2]李玉瑞，主编.细胞外间质的生物化学及研究方法.北京:人民卫生出社，1988. 172-181，232-234.
[3]汪涌，何清濂，林子豪，等.生长因子与皮肤伤口愈合[J]. 中华整形烧伤外科杂志，1999，15 462-464.
[4]Greenhalgh DG.The role of growth factors in wound healing. J Trauma， 1996， 41 :159.
[5]CelebiN，ErdenN，GonulB， et al. Effects of epidermal growth factor dosage for msondermal wound strength in mice. J Pharmacol， 1994， 46 :386.