关于重组别藻蓝蛋白对小鼠H22肿瘤生长及COX2、VEGF和PCNA表达的影响

【摘要】 目的 观察重组别藻蓝蛋白（rAPC）对接种h32细胞小鼠的肿瘤生长及环氧化酶2（COX2）、血管内皮生长因子（VEGF）、增殖细胞核抗原（PCNA）表达的影响，并初步探讨其可能的机制。方法 昆明小鼠随机分为5组（n=10），即模型组，rAPC低、中、高剂量组（25、50、100 mg·kg-1·d-1），环磷酰胺组（CY对照组）。各组小鼠左前腋下皮下接种h32肝癌细胞，第2天除模型组外，其余4组分别以不同剂量的rAPC、CY灌胃， 15 d后处死，剥离出肿瘤，称质量，计算抑瘤率； 用免疫组化法测定肿瘤组织中COX2、VEGF和PCNA的表达。结果 rAPC低、中、高剂量组小鼠h32肿瘤质量增长均较模型组缓慢，差异有显著性（F=8.926，q=3.794～7.684，P&<0.05、0.01），其抑瘤率分别为25.2%、36.7%、43.1%。rAPC各剂量组COX2、VEGF阳性表达均低于模型组（F=23.651、7.244，q=3.985～11.307，P&<0.01）; rAPC中、高剂量组PCNA 阳性表达较模型组显著减少（F=164.380，q=1.513～31.265，P&<0.01）。结论 rAPC可以抑制小鼠h32肿瘤的生长及COX2、VEGF和PCNA的表达。
【关键词】 别藻蓝蛋白；肝肿瘤；环氧化酶 2；血管内皮生长因子；增殖细胞核抗原；小鼠
　［ABSTRACT］ Objective To observe the effect of recombinant allophycocyanin (rAPC) on tumor growth， COX2， VEGF and PCNA in h32 mice and approach its possible mechanism. Methods Kunming mice were randomized to five groups as the model group， low， middle， and highdose rAPC groups (25，50，100 mg·kg-1·d-1， respectively)， and Cyclophosphamide group (control group) with 10 mice in each group. h32 cells were inoculated subcutaneously at left anterior armpit of the mice. Animals of the four groups， except the model group， were given different dosages of rAPC and CY on the second day and killed after 15 days. The tumors were removed， weighed， and tumor inhibition rate calculated; the expressions of COX2， VEGF and PCNA in the tumor were determined immunohistochemically. Results The increase of tumor weight in low， middle， and highdose groups was slower than that of the control (F=8.926，q=3.794，P&<0.05)， the inhibition rate was 25.2%， 36.7%， and 43.1%， respectively. The expressions of COX2 and VEGF in the three differentdose groups were lower than that of the model group(F=23.651;q=4.476-11.307;P&<0.01)， the expression of PCNA in middleand highdose rAPC groups was less than the model(F=164.380;q=1.513-31.265;P&<0.01). Conclusion rAPC inhibits tumor growth and expressions of COX2， VEGF and PCNA in h32 mice.
　　
　　［KEY WORDS］ allophycocyanin; liver neoplasms; cyclooxygenase 2; vascular endothelial growth factor; proliferating cell nuclear antigen; mice
　　
　　藻胆蛋白(PBP)是原核藻类——蓝藻，真核藻类——红藻、隐藻和某些甲藻所特有的光合作用的捕光色素蛋白。根据在光合作用中受能先后的不同，PBP分为藻红蛋白（PEC）、藻蓝蛋白（PC）和别藻蓝蛋白(APC)3种[1]。前期研究显示，PBP对消化系统肿瘤有抑制作用。秦松等[2]从蓝藻Anacystis nidulans UTEX625中克隆了APC基因，并在大肠杆菌(Escherichia coli)表达了带有麦芽糖结合蛋白（MBP）标签的重组别藻蓝蛋白(rAPC)。已有研究表明，rAPC对小鼠S180肉瘤及h32肝癌模型均具有显著的抑制效果[3]，但其抗肿瘤活性的机制仍未知。环氧化酶2（COX2）是一种诱导酶，多数恶性肿瘤COX2过度表达，且其表达水平与肿瘤的发生、发展、预后和转移有密切的关系。血管内皮生长
1期徐清燕，梁惠，秦松. 重组别藻蓝蛋白对小鼠h32肿瘤生长及COX2、VEGF和PCNA表达的影响23
因子(VEGF)和增殖细胞核抗原（PCNA）可促进肿瘤间质血管的生成，也是导致肿瘤细胞不断生长繁殖，进而产生浸润转移的原因之一。本文应用动物实验及免疫组织化学的方法，研究rAPC对昆明小鼠h32 肿瘤组织中COX2、VEGF及PCNA表达的影响，并初步探讨其可能的机制，以寻找具有高度生物活性的新的海洋药物。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 rAPC 由中国科学院海洋研究所提供。
　　1.1.2 实验动物及瘤株
　　清洁级昆明小鼠50只，体质量18～23 g，雄性，由青岛市实验动物中心提供。小鼠肝癌细胞株，由中国医学科学院药物研究所引进，山东省医学科学院药物研究所药理室低温冻存保种，复苏后传5、6、7代的细胞悬液。
　　1.1.3 主要试剂
　　新生牛血清，购自Gibico公司。兔抗人COX2抗体、兔抗人PCNA抗体以及兔抗人VEGF抗体，均购自青岛宏达通生物技术有限公司。DAB显色试剂盒、SP染色试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司。注射用环磷酰胺（CY，每瓶0.2 g），江苏恒瑞医药股份有限公司生产。
　　1.1.4 仪器
　　LEICA RM 2135切片机(德国)，ZMN7803型自动组织包埋机(常州华利电子公司产品)，生物图像分析系统(江苏捷达科技公司提供)，OLYMPUSBX50显微镜(日本OLYMPUS公司产品)，Simple PCI 图像分析系统 （V5.2，Compix Inc，美国）。
　　1.2 方法
　　1.2.1 动物模型的建立
　　50只昆明小鼠购进后适应性喂养1周，每只小鼠于右前肢腋窝皮下接种密度为2×109/L的h32瘤细胞悬液0.2 mL。24 h后，随机分为5组：模型组(给予生理盐水0.5 mL灌胃)，rAPC低、中、高剂量组（分别给予25、50、100 mg·kg-1·d-1rAPC灌胃），CY组（给予CY 40 mg·kg-1·d-1腹腔注射），每组10只。各组均连续给药2周。
　　1.2.2 样品采集
　　末次给药24 h后，小鼠称体质量，处死。无菌条件下解剖小鼠，完整剥离出肿瘤，准确称质量，计算抑瘤率。抑瘤率=（对照组平均瘤质量-给药组平均瘤质量）/对照组平均瘤质量×100%。
　　1.2.3 COX2、VEGF、PCNA表达检测
　　采用免疫组织化学法。取新鲜肿瘤组织常规做石蜡切片，按SP试剂盒说明染色，DAB显色，中性树胶封固，镜检，采用Simple PCI 图像分析系统分析肿瘤细胞中COX2、VEGF和PCNA的表达。每组切片随机选取5张，光镜下（40倍）每张切片按系统抽样法随机取10个视野；对所测定组织的背底进行灰度、吸光度测定；手动选择阳性细胞及阳性区域，计算机自动数据统计系统计算出所测细胞平均灰度、吸光度，以20个吸光度为主要指标进行统计学分析。吸光度越大，表明COX2、VEGF、PCNA阳性表达越强，相对应的灰度值应越小。其中COX2与VEGF阳性细胞均以胞质内出现棕黄色颗粒状染色为判定标准；PCNA 阳性细胞以胞核染色呈棕黄色胞浆无着色为判定标准。
　　1.3 统计学处理
　　
　　采用SPSS 13.0及PPMS 1.5[4]统计学软件进行数据处理，多组数据比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。
　　2 结果
　　2.1 实验小鼠的一般状态及成瘤情况
　　
　　rAPC组小鼠活动基本正常，精神状态良好，皮毛基本光洁，肿瘤生长潜伏期（TT）3 d，肿瘤生长缓慢；CY组小鼠活动正常，精神状态优于rAPC组， TT为4 d，肿瘤生长较rAPC组慢；模型组小鼠活动减少且消瘦，肿瘤扩散至颈部、下巴，出现张口呼吸，精神萎靡、毛色不清洁，TT为2 d，肿瘤生长最快。成瘤率100%。

　　2.2 各组肿瘤质量的比较
　　
　　rAPC各剂量组及CY组平均瘤质量均低于模型组，差异有显著性（F=8.926，q=3.794～7.684，P&<0.05、0.01）；CY组平均瘤质量虽然低于rAPC各剂量组，但差异无显著性（P&>0.05）。见表1。表1 各组小鼠肿瘤质量的比较(略)

转贴于 　　2.3 各组COX2、VEGF、PCNA表达的比较
　　2.3.1 COX2的表达
　　 rAPC各剂量组及CY组 COX2阳性表达明显低于模型组，且rAPC低剂量组阳性表达明显高于中、高剂量组及CY组，差异均有显著意义（F=23.651，q=4.005～11.307，P&<0.01）；rAPC中、高剂量组COX2的表达虽高于CY组，但差异无显著性（P&>0.05），见表2。模型组细胞大小不等，异型性明显，核分裂象多见，COX2阳性细胞（胞质内有大小不等的棕黄色颗粒）明显，色泽较深；rAPC高剂量组和CY组细胞大小较均匀，细胞分化程度较高，异型性低，核分裂象少见，COX2阳性细胞明显减少，色泽较浅，特别是CY组仅出现微弱表达。表2 各组COX2表达的比较(略)
　　2.3.2 VEGF表达
　　rAPC各剂量组及CY组的VEGF阳性表达均低于模型组（F=7.244，q=3.985～7.104，P&<0.01），但各剂量组两两之间VEGF表达差异无统计学意义（P&>0.05）；CY组VEGF阳性表达虽低于rAPC各剂量组，但差异无统计学意义（P&>0.05）。见表3。模型组细胞大小不等，异型性明显，核分裂象多见，VEGF阳性细胞明显，色泽较深；rAPC高剂量组和CY组肿瘤细胞分化程度较高，异型性低，核分裂象少见，VEGF阳性细胞明显减少，色泽较浅，仅出现微弱表达。表3 各组VEGF表达的比较（略）
　　
　　2.3.3 PCNA表达
　　rAPC中、高剂量组及CY组PCNA 阳性表达较模型组显著减少，低剂量组阳性表达明显高于中、高剂量组及CY组，CY组PCNA 阳性表达较rAPC各剂量组减少，差异均有显著性（F=164.380，q=1.513～31.265，P&<0.01），见表4。rAPC高剂量组、CY组胞核染色呈棕黄色的细胞明显少于模型组，即PCNA 阳性细胞数明显低于模型组，色泽较浅。表4 各组PCNA表达的比较(略)
　　
　　3 讨论
　　肝癌是典型的富血管肿瘤，其侵袭性生长及转移依赖于新生血管提供营养和排泄代谢产物，抑制血管生成在抗肝肿瘤的研究中意义重大。COX是花生四烯酸生物合成前列腺素（PG）过程中的重要限速酶，哺乳动物的COX有两种形式，即 COX1和COX2。COX1属于结构型基因，在正常组织和细胞中表达；而 COX2属于诱导型基因，是一种诱导酶，在正常生理状态下多数组织内几乎检测不到，而在细胞受到各种刺激，如组织损伤、炎症或细胞恶性转化时表达增强[5]。有资料表明，COX2既可通过肿瘤细胞促进血管生长肽如VEGF、碱性成纤维生长因子（bFGF）及一氧化氮（NO）的释放，也可通过直接增加PG的合成而调节肿瘤血管生成[68]。本文实验结果表明，rAPC各剂量组COX2阳性表达均低于模型组，且具有浓度差异性，推断rAPC可能是通过抑制COX2的表达而发挥抗肿瘤的作用。
　　
　　VEGF为相对分子质量为3.6万～4.5万的二聚体糖蛋白，是目前己知最强烈的血管生成诱导因子。它调控血管形成作用强，特异性高，具有促进血管内皮细胞增殖、刺激体内新血管生成和增加血管通透性，维持血管正常状态和结构完整性的作用，是肿瘤微血管生成和侵袭转移中的关键因素。VEGF高表达于多种恶性肿瘤，如胶质瘤、肺癌、乳癌和肾癌等[9]。HIROHASHI等[10]研究也显示，VEGF高表达有利于原发性肝癌的复发、侵袭和转移，并与肝癌的临床病理特征密切相关。本文实验结果表明，rAPC能有效抑制肿瘤细胞VEGF的表达，这可能是其抗肿瘤及血管生成的一个重要原因。
　　
　　PCNA是反映细胞增殖状态的特异性核抗原， 是DNA聚合酶的一种辅助蛋白，对DNA的调节起着重要作用，PCNA的量增多，DNA合成量也增多。因此，其在细胞核内阳性表达的高低与细胞增殖活性密切相关，是一种准确、简便、直观研究、评价细胞增殖状态的重要指标。另外，VEGF升高，促使肿瘤新生血管增多，进而肿瘤细胞代偿性增生，加速分裂，导致肿瘤细胞增殖活性提高，即PCNA升高。表明PCNA、VEGF在肝肿瘤的发生过程中起到协同作用[11]。本文研究结果显示，rAPC中、高剂量组PCNA表达较模型组显著减少，且与低剂量组比较差异有显著性，说明rAPC能有效抑制肿瘤细胞PCNA的表达。
　　综上所述，rAPC对COX2、VEGF和PCNA的表达有显著抑制作用，说明rAPC能较好发挥抗肿瘤的作用，而且可能存在浓度相关性。通过细菌发酵和蛋白提纯得到的rAPC化学成分简单，氨基酸序列清楚，高级结构稳定性好，并实现了大规模的生产，是一种理想的海洋药物。

参考文献

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