【摘要】 目的 应用经过化学修饰的小干扰RNA（siRNA）在体外抑制血管内皮生长因子C（VEGF-C）基因的表达， 探讨化学修饰的siRNA介导的RNA干扰技术对乳癌基因治疗的可行性和特异性。方法 设计针对VEGF-C基因的siRNA，选用阳离子脂质体LipofectamineTM 2000作为转染试剂，以脂质体转染法将双链siRNA导入人乳癌细胞株MCF-7细胞，设立空白对照组（只加无血清无抗生素培养基）、脂质体组（每孔只加LipofectamineTM 2000 0.5 μL）、3个siRNA浓度梯度组（50、100、200 nmol／L）及siRNA SCR组（100 nmol/L），用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测siRNA对 MCF-7细胞增殖的影响，通过Hoechst 33258 染色观察MCF-7细胞的凋亡，采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot分别检测转染前后VEGF-C基因和p53基因的 mRNA及蛋白表达变化。结果 转染VEGF-C siRNA 48 h后MCF-7细胞生长受到抑制，Hoechst 33258荧光染色显示转染siRNA 72 h后细胞内可见凋亡小体。VEGF-C基因和p53基因 mRNA和蛋白水平表达明显降低（F=30.74～114.11，q=5.74～20.75，P&<0.01），空白对照组、脂质体组和siRNA SCR组各指标差异无显著性（P&>0.05）。结论 化学修饰的siRNA介导的RNA干扰能下调靶基因VEGF-C的表达和抑制MCF-7细胞增殖，乳癌中p53与VEGF-C表达有关，提示突变型p53可能参与VEGF-C表达的调控
【关键词】 RNA，小分子干扰；乳腺肿瘤;血管内皮生长因子C；细胞增殖；细胞凋亡
［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the feasibility and specificity of gene therapy for breast cancer by chemically modified siRNA mediated RNA interference using in-vitro RNA （siRNA） inhibited vascular endothelial growth factor-C （VEGF-C） expression.Methods siRNA targeting VEGF-C gene was designed， cationic liposome LipofectamineTM 2000 used as transfecing agent， and ds-siRNA was transfected into MCF-7 cells with lipofectamine. Blank control group （only serum- and antibiotic-free medium was added）， liposome control group （only LipofectamineTM 2000）， three siRNA-concentration-gradient groups （50， 100 and 200 nmol／L） and siRNA SCR group （100 nmol/L） were established. The proliferation of MCF-7 cells was detected by MTT colorimetry， and apoptosis measured by Hoechst 33258 staining. The expressions of mRNA of VEGF-C and p53 gene were detected by both RT-PCR and Western blot before and after transfection. ［ Results The growth of MCF-7 cells was inhibited at 48 h after siRNA transfection，and apoptosis bodies were observed in cells with fluorescent stain by Hoechst 33258. The expressions of VEGF-C and p53 were significantly down-regulated （F=30.74-114.11，q=5.74-20.75，P&<0.01）. No significance of differences was noted among blank control， lipofectamine control and siRNA SCR groups （P&>0.05） ConclusionThe interference of modified siRNA with chemically-mediated RNAi can down regulate VEGF-C gene expression and inhibit cell proliferation of MCF-7. The p53 gene in breast cancer is associated with the expression of VEGF-C， which indicates that mutant p53 is likely involved in the regulation of VEGF-C.
［KEY WORDS］ RNA， micromolecule interference; Breast neoplasms; Vascular endothelial growth factor C; Cell proliferation; Apoptosis
血管内皮生长因子C（VEGF-C）是近年来发现的VEGF家族新成员，它通过对肿瘤间质新生淋巴管内皮细胞增殖和迁移的调控，促进肿瘤的淋巴管形成，其在肿瘤局部浸润、远处转移过程中起着重要作用［1，2］。p53存在于多种肿瘤中，突变的P53蛋白可通过“负显性效应”阻碍野生型p53基因的抑制生长功能，这样突变型P53蛋白将导致肿瘤进一步生长［3］。现已有研究结果表明，野生型p53可以抑制VEGF的表达， 并通过旁观效应抑制肿瘤的生长和转移， 而突变型p53则可以上调VEGF的表达， 促进血管生成从而促进肿瘤的生长和转移， 但也有相反的报道［3，4］。
RNA干扰（RNAi）是由外源性或内源性的双链RNA（dsRNA）导入细胞而引起的mRNA降解，进而抑制其相应的基因表达。在RNAi过程中，当双链RNA进入细胞后，被Dicer切割成长度为21～25个核苷酸的小分子双链RNA，即siRNA，后者是RNAi的引发物。siRNA是RNAi的效应分子，siRNA最早在植物中被发现，体外合成siRNA则是RNAi技术的最新发展，尤其是在特异性抑制哺乳动物细胞基因表达方面，为基因治疗开创了新的途径。然而，siRNA在活体内稳定性和靶向性的问题使其应用受到限制［4］。本实验依据RNAi原理，设计合成针对人VEGF-C基因的siRNA，并对其进行化学修饰，以人类乳癌细胞株MCF-7为研究对象，选用LipofectamineTM 2000作为转染试剂，体外培养细胞，研究siRNA特异诱导VEGF-C基因转录后沉默对细胞和瘤体增殖的抑制作用，同时检测突变型p53基因的表达，以探讨化学修饰的siRNA介导的RNAi作为肿瘤基因治疗的可行性。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株
人乳癌细胞株MCF-7购自中国协和基础学院细胞中心。常规培养于含体积分数0.10胎牛血清的DMEM（GIBCO公司产品）培养液中，置于含体积分数0.05的CO2、37 ℃饱和湿度的孵箱中培养传代。
1.1.2 主要试剂
DMEM培养基、LipofectamineTM 2000 及Trizol Reagent，Invitrogen公司生产；AMV逆转录试剂盒，Promega公司生产；所有一抗（VEGF-C和p53）均为Santa Cruz公司生产；Hoechst 33258由碧云天生物试剂公司提供；所有引物均由上海生工公司合成。
1.2 siRNA 设计合成
首先在美国国立生物技术信息中心NCBI数据库中获取VEGF-C和p53基因 mRNA的序列全长（序列号：NM005429），结合设计软件和文献报道，确定VEGF-C siRNA序列为：5′-CCAAUUACAUGUGGAAUAATT-3′（正义链），5′-UUAUUCCACAUGUAAUUGGTG-3′（反义链）。进行BLAST比对检查以保证该序列和其他基因没有同源性。并且对VEGF-C siRNA正义链行氟代修饰，反义链不修饰，由上海吉玛化学合成。见表1。
1.3 转染
选用阳离子脂质体LipofectamineTM 2000作为转染试剂，根据LipofectamineTM 2000试剂操作指南，采用通用型荧光标记的阴性对照siRNA进行转染条件的优化。取对数生长期的MCF-7细胞，调整细胞的密度，接种于12孔板，用含体积分数0.10血清、不含抗生素的DMEM培养，次日细胞贴壁生长后弃去旧培养液待转染。siRNA与LipofectamineTM 2000分别用适量不含血清和抗生素的DMEM稀释，5 min内将其混合，室温静置20 min后加入细胞板孔中，置于培养箱常规培养。6 h后荧光显微镜下观察转染效率。选用siRNA与LipofectamineTM2000最佳转染比例。
1.4 四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测细胞增殖
收集对数生长期细胞接种于96孔板，密度为6×107/L，设立空白对照组（只加无血清无抗生素培养基）、脂质体组（每孔只加LipofectamineTM 2000 0.5 μL）、3个siRNA浓度组（50、100、200 nmol／L）、错义序列（siRNA SCR）组 （100 nmol/L），每组做6个平行孔，每孔终体积为100 μL，按1.3方法进行转染。培养48 h后每孔加入MTT（5 g／L）20 μL，继续培育4 h，弃上清，每孔加入DMSO 100 μL，振荡10 min，使结晶充分溶解，在全自动酶标仪上测各孔490 nm波长处的吸光度（A），以公式（1-A／C）×100％计算siRNA对肿瘤细胞的生长抑制率（A、C分别为给药组细胞和对照组吸光度平均值）。
1.5 Hoechst 33258 染色检测细胞凋亡
取对数生长期的MCF-7 细胞爬片过夜使其贴壁，转染VEGF-C siRNA 72 h 后，吸净培养液，固定液（体积分数0.75甲醇+体积分数0.25冰醋酸） 4 ℃固定10 min， PBS 漂洗2 次，加入5 g/L Hoechst 33258， 37 ℃避光染色10 min，再次PBS 漂洗后以封片液（体积分数0.50的PBS+体积分数0.50甘油）封片，荧光显微镜下观察。实验重复3次。
1.6 半定量RT-PCR检测 mRNA表达水平
细胞接种于6孔板，转染24 h 后，按照Trizol 试剂盒操作说明提取细胞总RNA，将其溶于50 μL无酶水中， Eppendorf 核酸定量测定仪检测RNA 浓度和纯度，并行琼脂糖凝胶电泳观察完整性。将1 μg总RNA 行20 μL体系逆转录反应，取cDNA 后续25 μL体系行PCR反应，并以无RNA酶水作为阴性对照。各基因PCR 扩增引物序列见表1。以GAPDH 基因作为内参平行RT-PCR 操作。产物经琼脂糖凝胶电泳后拍照并运用天能分析软件对条带进行扫描，检测基因扩增产物与其对应的内参扩增产物吸光度扫描值，然后计算AVEGF-C/AGAPDH和Ap53/AGAPDH的比值。实验重复3 次。表1 VEGF-C和p53基因所用引物序列长度及退火温度（略）
1.7 Western blot检测蛋白表达水平
常规消化收集已转染48 h 的细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS） 漂洗2 次，弃上清，加入细胞裂解液（含体积分数0.001 SDS，体积分数0.005去氧胆酸钠，100 mg/L PMSF，0.02 g/L叠氮钠，1 g/L NP-40，1 kg/L 抑蛋白酶肽，150 mmol/L NaCl 和50 mmol/LTris-HCl， pH 7.5），冰上充分裂解，4 ℃ 12 000 r/min 离心5 min，收集上清液定量，取100 g 蛋白上样，行120 g/L SDS-PAGE电泳，蛋白充分分离后，转移到PVDF 膜（Sigma公司）上，于含50 g/L脱脂奶粉的封闭液中4 ℃过夜。VEGF-C 一抗（1∶300） 室温孵育2 h，二抗（1∶2 000） 室温孵育1 h，DAB对PVDF膜进行显色反应。对条带进行吸光度扫描，计算AVEGF-C/Aβ-actin和Ap53/Aβ-actin的比值。实验重复3次。
1.8 统计学处理
实验结果以x±s表示，应用SPSS 14.0及PPMS 1.5［6］统计学软件进行数据处理。多组数据间比较采用单因素方差分析。
2 结 果
2.1 siRNA对 MCF-7细胞增殖的影响
显微镜下观察，转染VEGF-C siRNA 48 h后，贴壁生长的MCF-7细胞发生明显的形态学改变，细胞皱缩、变圆，部分细胞死亡脱落，细胞增殖减慢。MTT 检测显示，VEGF-C siRNA不同浓度组MCF-7细胞抑制率与脂质体组比较差异有显著性（F=32.34、56.47，q=8.77～10.98，P&<0.01）; siRNA SCR组与脂质体组比较差异无显著性 （P&>0.05）。siRNA 100 nmol/L 组和200 nmol/L 组之间比较差异无统计学意义（P&>0.05）。见表2。表2 转染VEGF-C siRNA后各组MCF-7细胞抑制率比较（略）
2.2 Hoechst 荧光染色检查
荧光显微镜下观察可见，对照组、siRNA SCR组以及脂质体组的细胞核呈弥散均匀的荧光。转染VEGF-C siRNA 72 h 后，细胞表现出典型的凋亡形态学变化，细胞核固缩，染色质高度凝聚、边缘化，细胞核或细胞质内出现致密浓染的颗粒状荧光，有的细胞可见明显的核裂解和凋亡小体。
2.3 转染VEGF-C siRNA 24 h后MCF-7 细胞VEGF和p53 mRNA表达
与空白对照组相比较，50 nmol/L VEGF-C siRNA组、脂质体组、siRNA SCR组AVEGF-C/AGAPDH的比值差异均无统计学意义（P&>0.05）；VEGF-C siRNA 100 nmol/L组和200 nmol/L 组AVEGF-C/AGAPDH的比值差异有统计学意义（F=30.74，q=6.11～17.28，P&<0.01）。VEGF-C siRNA 100 nmol/L和200 nmol/L两组之间AVEGF-C/AGAPDH的比值比较差异无统计学意义（P&>0.05）。100 nmol/L VEGF-C siRNA转染细胞24 h后p53基因mRNA表达下降（F=38.56，q=5.74，P&<0.05），空白对照组、脂质体组和siRNA SCR组比较差异无统计学意义（P&>0.05）。见表3。表3 转染VEGF-C siRNA 24 h后各组MCF-7 细胞VEGF和p53 mRNA 表达比较（略）
2.4 转染VEGF-C siRNA后MCF-7细胞VEGF和p53蛋白表达
与空白对照组相比较，VEGF-C siRNA组的VEGF-C 和p53蛋白的表达显著下降，差异有显著性（F=78.34、114.11，q=9.31～20.75，P&<0.01）， 脂质体组和siRNA SCR组靶基因VEGF和p53蛋白表达差异无显著性（P&>0.05）。见表4。表4 转染VEGF-C siRNA 后各组MCF-7 细胞VEGF和p53蛋白表达比较（略）
肿瘤的新生淋巴管形成参与肿瘤的增生、侵袭和肿瘤细胞向远处转移等多种恶性过程。VEGF-C是新发现的一种与VEGF同源的内皮细胞生长因子，被称为淋巴管生长因子，其主要作用是诱导淋巴管内皮细胞增殖、迁徙，并增加淋巴管的通透性［5］。国外多数学者实验结果表明，VEGF-C促进肿瘤间质淋巴管生成，间质内淋巴管密度增大，扩大了癌细胞与淋巴管接触的机会，为癌细胞的转移创造了条件，腋淋巴结转移组乳癌淋巴管密度明显高于无腋淋巴结转移组［7，8］。
近年来，基于RNAi机制治疗疾病的战略引起了人们极大兴趣。RNAi有潜在的和高特异性的基因沉默功能，在临床上可用于肿瘤、病毒、炎症、心血管及神经退行性疾病等的治疗，将来有望成为基因治疗理想工具。siRNA是RNAi 作用中不可缺少的重要环节。体外合成siRNA 应用则是RNAi 技术的新发展，尤其是在特异性抑制哺乳动物基因方面，既可以特异性抑制、降解同源mRNA 序列，有效阻止相应蛋白表达；又可避免长链dsRNA 引起的非特异性基因降解和细胞死亡，为哺乳动物细胞的基因治疗开辟了新的途径。
本实验选用化学合成方法获得siRNA，并对siRNA 进行核苷酸戊糖2′-羟基的甲基化修饰。然后，以阳离子脂质体为转染试剂，应用FAM-6-羧基荧光素标记的通用型阴性对照优化转染条件，得到siRNA 与LipofectamineTM 2000最佳的质量体积比为10 pmol∶0.5 μL。体外培养的肿瘤细胞转染VEGF-C siRNA后，通过MTT 实验证实其对细胞增殖有抑制作用，半定量RT-PCR和Western blot 均检测到VEGF-C mRNA和蛋白水平显著降低。Hoechst荧光染色证实，细胞呈现凋亡的形态学变化特征：胞体缩小，与周围细胞失去联系，细胞器变致密，核体积缩小，染色体断裂，核膜和细胞膜均内陷，包裹内形成凋亡小体。表明VEGF-C siRNA 对细胞增殖有抑制作用，且在一定范围内抑制率随着浓度增加而增加，终浓度为100 nmol/L时已基本达最佳抑制效果，增加siRNA 浓度并不显著提高沉默作用。
关于肿瘤血管形成因子VEGF-C与突变型p53的关系，KAKOLYRIS 等［8］报道，突变型p53阴性的癌细胞中VEGF-C 表达低，且成熟的新生血管密度高；而突变型p53阳性的癌细胞中VEGF-C表达高，不成熟血管密度高。此外，VEGF亦与p53突变有密切关系，p53基因突变可以下调抑制血管增生的凝血酶反应素-1（TSP-1）和上调促进血管增生的VEGF，因而成为调控肿瘤血管生长的重要因素。 KONDO等［9］研究结果也显示，突变型p53可诱导VEGF表达。本文研究结果显示，靶向VEGF-C 的siRNA在有效抑制靶基因的同时，p53基因表达亦相应降低，提示突变型p53可能参与VEGF-C表达的调控，从而参与乳癌组织血管生成调节。p53和VEGF-C对乳癌生长浸润和转移可能具有一定的协同作用。同时检测VEGF-C及p53，有利于评估乳癌的生物学行为及预后，对制定乳癌术后治疗方案有重要的指导意义。
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